1、SN/T0868-2017出口甜叶菊中总糖甙含量的测定1范围本标准规定了出口甜叶菊中总糖甙含量的测定方法。本标准适用了甜叶菊中总糖甙的检测和确证。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法第一法高效液相色谱法3方法提要试样中的总糖甙用水超声提取，用带有紫外检测器的液相色谱仪（波长200m)测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙腈：色
2、谱纯。4.2乙腈-水溶液(78+22，体积比)：取78mL的乙腈，加入22mL的水，混匀。4.3标准物质：甜菊糖甙(CAS号57817-89-7)纯度98%。4.4标准物质：瑞鲍迪甙A(CAS号58543-16-1)纯度98%。4.5标准物质：瑞鲍迪甙C(CAS号63550-99-2)纯度98%。4.6标准物质：杜克甙A(CAS号64432-06-0)纯度98%。4.7标准物质：甜菊双糖甙(CAS号41093-60-1)纯度93%。4.8甜菊糖甙标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取甜菊糖甙标准物质10.0mg(精确至0.1mg),用4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于04冰箱可保
3、存6个月。4.9瑞鲍迪甙A标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取瑞鲍迪甙A标准物质10.0mg(精确至0.1mg),用4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于04冰箱可保存6个月。4.10瑞鲍迪甙C标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取瑞鲍迪甙C标准物质10.0mg(精确至0.1mg),用4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于04冰箱可保存6个月。4.11杜克甙A标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取杜克甙A标准物质10.0mg(精确至0.1mg),用4,2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于04冰箱可保存6个月。4.12甜菊双糖甙标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称
4、取甜菊双糖甙标准物质10.0mg(精确至0.1mg),用4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于04冰箱可保存6个月。1SN/T0868-20174.13总糖武混合标准中间溶液：1.0mg/mL。分别准确吸取甜菊糖甙、瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙C、杜克甙A和甜菊双糖甙标准储备溶液2mL于10mL容量瓶中，配制成浓度为1.0mg/mL混合标准中间溶液。所配制溶液于0一4冰箱可保存3个月。4.14总糖甙混合标准工作溶液：根据需要吸取适量混合标准中间溶液，用4.2溶液稀释成适当的混合标准工作溶液。混合标准工作溶液现用现配。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。5.2液相
5、色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子(ESI)源。5.3分析天平：感量为0.1mg和0.01g.5.4涡旋混合器。5.5离心机：转速不低于4000r/min。5.6超声波清洗器。6分析步骤6.1试样处理称取约0.5g试样（精确至0.001g)于50mL离心管中，用水定容至50mL,振荡，超声提取15min,吸取500L,加人500L乙腈振荡混匀，15000r/min离心5min,过022um有机相滤膜，供HPLC测定。6.2液相色谱测定6.2.1色谱参考条件色谱参考条件如下：a)色谱柱：氨基柱，250mmX4.6mm(内径)，5m,或性能相当者b)柱温：室温。c)流动相：乙腈-水(78+22，体积
6、比)。d)流速：0.8mL/min.e)检测波长：220nm。f)进样量：10L。6.2.2色谱测定在仪器最佳工作条件下，用标准工作溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定线性范围内。在上述色谱条件下，混合标准溶液色谱图参见附录A。6.3液相色谱-质谱/质谱确证6.3.1色谱参考条件色谱参考条件如下：a)色谱柱：氨基柱，150mm4.6mm(内径)，5um,或性能相当者。b)流动相：乙腈-水(78+22，体积比)。2SN/T0868-2017c)流速：0.5mL/min。d)进样量：5L。
7、6.3.2质谱参考条件质谱参考条件如下：a)电离方式：电喷雾电离，负离子。b)扫描方式：选择反应监测(SRM)。c)雾化气、气帘气、辅助加热气，碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件参见附录B中表B.1,五种甜菊糖甙标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图见附录C6.3.3定性测定按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品一致，定量测定时采用标准曲线法测定。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对离子丰度允许偏差不超过表1的规定的范围，则可判定样品中存在对应的被测物。5种甜菊糖甙标准
8、溶液的多反应监测色谱图参见附录C。表1液相色谱-串联质谱法确证试验时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5020-5010-2010允许的相对偏差/%土20+30506.4空白试验除不加试样外，均按以上操作步骤进行。7结果计算和表述试样中甜菊糖甙的含量按式(1)进行计算：X-X100(1）m1000式中：X一试样中甜菊糖甙的含量，单位为毫克每百克(mg/100g):c样液中甜菊糖甙的测定值，单位为微克每毫升(g/mL)；试样的最后定容体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位克(g):1000由g/mL换算成mg/ml的换算因子；100由mg/g换算成mg/100g的换算因子。甜菊糖甙、瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙C、杜克甙A和甜菊双糖武各组分之和即为总糖甙含量。8定量限和回收率8.1定量限甜叶菊中的甜菊糖甙、瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙C、杜克甙A和甜菊双糖甙的定量限为0.05%。
