1、 ICS 11.220 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 29062023 牛副流感病毒 3 型检测技术规范 Technical specification for diagnostic of bovine parainfluenza virus type 3 2023-03-10 发布 2023-04-10 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 29062023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草
2、单位：内蒙古大学、内蒙古蒙微生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古科技大学包头师范学院、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、吉林农业科技学院。本文件主要起草人：王炜、王镓磊、马艳华、赵丽霞、杨昱萍、陈坚、郭宇、郭利、武有志、王岩、胡薇。DB15/T 29062023 1 牛副流感病毒 3 型检测技术规范 1 范围 本文件规定了牛副流感3型的临床诊断、病原分离鉴定、RT-PCR、ELISA等诊断技术要求。本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对牛副流感病毒3型的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中
3、，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。牛副流感病毒 3 型 bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3 属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒（见附录A中图A.1）。4 临床诊断 流行病学 牛副流感一年四季均可发生，以秋冬、初春季多见。各种年龄牛均可感染。病牛和带毒牛是本病主要传染源，可经接触、呼吸道和子宫内感
4、染，多与其它疾病混合感染。临床症状 感染牛主要临床表现为高热（体温41）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液、咳嗽、喘等呼吸道症状。病理剖解可见支气管肺炎，支气管黏膜肿胀、出血，管腔中有纤维素块，局部肺组织见灰色或红色肝样实变等。5 实验室诊断 病毒分离 DB15/T 29062023 2 5.1.1 试剂耗材 牛肾细胞系（MDBK细胞系）、棉签、马血清（HBS）、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。5.1.2 仪器 电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。5.1.3 病料采集 5.1.3.1 鼻拭子 用无菌棉签刮取鼻道分泌物，然后放入3 mL5 mL
5、含1000 IU/mL青霉素和1000 g/mL链霉素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.3.2 血清 使用非抗凝采血管采集新鲜血液2 mL5 mL，静置分离血清，编号，记录，于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.3.3 肺组织 疑似因BPIV3感染死亡的牛，按照NY/T 541的规定采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.4 样品处理 5.1.4.1 拭子 将鼻拭子样品液冻融两次，然后以6000 r/min 离心10 min，再使用一次性注射器吸取上清经0.22m滤膜过滤除菌，-20 以下
6、保存备用。5.1.4.2 血清 将静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20 以下保存备用。5.1.4.3 肺组织 取体积大小为223 cm肺组织样品，按照体积比为1:31:5的比例加入含有双抗的PBS（pH7.27.4），研磨成匀浆液，冻融两次，再以6000 r/min 离心10 min，取上清经0.22 m 滤膜过滤除菌，-20 下保存备用。5.1.5 细胞接种 取处理过的样品接种到长满80%的24孔板MDBK细胞，每孔200L，置于37，含5%CO2的培养箱中吸附30 min后，加入含3.5%HBS的细胞培养液1 mL，同时设对照组，置于37，5%CO2培养箱，培养3 d5 d，逐日观察，记
7、录细胞病变。按上述方法盲传35代。5.1.6 结果判定 细胞大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状（见附录A.2），当70%80%细胞出现病变时收获培养物，经反复冻融，以3000 r/min离心10 min，取上清进行5.2的检测。RT-PCR DB15/T 29062023 3 5.2.1 试剂耗材 移液器、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、阳性质粒（阳性对照）、灭菌超纯水（阴性对照）、引物。5.2.2 仪器 PCR仪、台式冷冻离心机、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。5.2.3 待检样品 处理的样品或细胞培养物。5
8、.2.4 病毒 RNA 提取 用病毒RNA提取试剂盒提取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品RNA，并使用核酸分析仪对RNA质量及含量进行测定。5.2.5 RT-PCR 反应体系 5.2.5.1 RT 反应 引物BPIV3-F/BPIV3-R 按照附录A.3进行引物序列合成并用无菌的DEPC处理水配制成10mol/L。20 L体系：下游引物1 L，dNTP Mixture 1 L，模板RNA 2 L，RNase Free dH2O 6 L。65 保温5 min 后，冰上迅速冷却。在上述 Microtube 管加5Prime Script II Buffer 4 L，RNase Inhi
9、bitor(40 U/L)0.5 L(20 U)，Prime Script II RTase(200 U/L)1 L，RNase Free dH2O 4.5 L，缓慢混匀。反应条件为42 45 min，95 5 min后，冰上冷却。5.2.5.2 PCR 反应 5.2.5.2.1 反应体系 Premix溶液12.5 L，上下游引物各0.5 L，cDNA 模板2 L，RNase Free dH2O 9.5 L。5.2.5.2.2 反应条件 95 预变性5 min,95 30 s，55 30 s，72 60 s，进行35个循环，72 延伸10 min。5.2.6 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳和成像
10、取PCR产物10 L，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压100 V，时间30 min，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果。5.2.7 结果判定 当阳性对照样品出现506 bp扩增带、阴性对照样品无扩增带出现时，试验结果成立。被检样品出现506 bp扩增带为牛副流感病毒3型阳性，否则为阴性（见附录A中图A.2）。间接 ELISA 抗体检测 5.3.1 试剂耗材 DB15/T 29062023 4 牛副流感病毒3型重组N蛋白、阴性血清、阳性血清、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG、酶标板、TMB底物显色试剂盒，抗原包被缓冲液、洗涤液、封闭液、终止液按照附录B配制，用水标准应符合GB/T 6682要求
11、。5.3.2 仪器 水浴锅、温箱、洗板机、微量振荡器、酶标仪、移液器。5.3.3 操作方法 5.3.3.1 抗原包被 BPIV3重组N蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.05 g/mL包被反应板，每孔100 L，4 包被16 h。5.3.3.2 洗板 甩掉孔内的包被液，洗涤液洗涤三次，200 L/孔。5.3.3.3 封闭 每孔加封闭液，200 L/孔，置37 封闭1 h,洗涤三次。5.3.3.4 加样 阴、阳性血清和被检血清均用封闭液作200倍稀释，每个样品两个平行，每孔100 L，每块板均设阴、阳性血清及稀释液对照各2孔。加样完毕后封板，放37 孵育1 h，洗涤三次。5.3.3.5 加酶标抗体
12、 每孔加入用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体100 L，置37再孵育1 h，洗涤三次。5.3.3.6 加底物溶液 加入显色底物（TMB）溶液100 L/孔，置37 避光反应15 min。5.3.3.7 终止反应 加入终止液50 L/孔,混匀后即刻测量OD450值。5.3.4 结果判定 P/N比法：被检样品(P)的吸光度值和阴性对照样品(N)值之比。P/N 1.50 判为阴性 2.0 P/N 1.50 判为可疑 P/N 2.0 判为阳性 6 综合判定 经 4 判定为疑似 BPIV3 感染病例，经 5.1 或 5.2 其中一种方法检测出 BPIV3，判为牛副流感病毒3 型感染。临床无明显特异症状的
13、非免疫动物经 5.3 检测出抗体阳性，判为牛副流感病毒 3 型感染。DB15/T 29062023 5 A A 附录A （资料性）病毒分离鉴定 A.1 牛副流感病毒 3 型简介 牛副流感病毒3型（Bovine parainfLuenza virus type 3，BPIV3）属于副黏病毒科呼吸道病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA，主要有3种常见的基因型，即A型、B型和C型。BPIV3在世界多个地区均有分离报道。该病一年四季均可发病，以秋冬、初春季多见。牛副流感病毒3型主要呈水平传播，患病牛的分泌物、排泄物、以及被患病牛污染的饲料垫料等均可能是传染源。牛感染BPIV3后会引起呼吸道症状。A
14、.2 BPIV3 细胞病变示意图 BPIV3细胞病变示意图见图A.1。注：图A：正常MDBK细胞对照图；图B：BPIV3感染MDBK细胞病变图。图A.1 BPIV3 细胞病变示意图 A.3 PCR 引物信息 A.3.1 PCR引物序列 PCR引物序列见表A.1.表A.1 PCR 引物序列 引物 序列(5-3)位置 目的片段 参考毒株 上游引物 CTGGAGTTATGCGATGGGTGT 993-1498 506 bp EU277658.1（Q5592）下游引物 TGTCGTTTGCGATGTTGGTT A.3.2 引物溶解 上下游引物用无菌的DEPC处理水配制成10 mol/L。A.3.3 B
15、PIV3 N 基因核苷酸序列片段 CTCAAGGCATTAATGGAATTGTATTTGTCAAAAGGGCCACGTGCACCTTTCATATGCATTTTGAGGGATCCTGTACACGGTGAATTTGCACCGGGAAATTACCCTGCTCTCTGGAGTTATGCTATGGGTGTAGCAGTTGTACAGAACAAGGCCATGCAACAGTATGTGACAGGACGATCTTATCTAGACATTGAAATGTTCCAACTTGGTCAGGCAGTAGCACGGGATGCTGAATCACAGATGAGCTCAATACTAGAGGATGAACTAGGGATAACACAGGAAG
16、CCAAACAGAGCTTGAAGAATCACATGAAAAGGATCAGTAGTTCAGATACAGCCTTCCAAAAACCAACAGDB15/T 29062023 6 GAGGAGCAGCCATAGAGATGGCAATAGATGAAGAAGTAGAGCAGCTTGATTCCAAAGGGGATCAAGACCAAAGCAACGGAAATCAGTCATCCATGATCCCCTATGCATGGGCAGATGAAACCAACAATAGCAATCAAACTGAACCAACAACAGA A.4 电泳结果 电泳结果见图A.2。注：M：DL2000；1：阳性对照；2：阴性对照。图A.2 PCR 电泳图 DB15/T 29062023 7 B B 附录B （规范性）试剂的配制 B.1 抗原包被缓冲液（0.05 mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液）碳酸钠 0.318 g 碳酸氢钠 0.588 g 去离子水 200 mL 用0.22 m滤膜过滤除菌，室温保存备用。B.2 洗涤液PBST pH7.4 PBS 1000 mL 吐温-20 0.5 mL 现配现用。B.3 封闭液（含 2%BSA 的 PBST
