1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪狑 犪 犾 犽 犲 狉 犻犆 犪 狊 狋 犾 犲 犫 狌 狉 狔犪 狀 犱犆 犪 狉 狉 犻 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本标准的附录和附录 为规范性附录，附录 和附录为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：易建平、周国梁、黄国明
2、、印丽萍。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了进出境植物检疫中黑麦草腥黑穗病菌（犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪狑 犪 犾 犽 犲 狉 犻）的检测和鉴定方法。本标准适用于进出境禾本科草种和粮谷类产品中黑麦草腥黑穗病菌的鉴定。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。植物检疫小麦矮化
3、腥黑穗病菌检疫鉴定方法缩略语下列缩略语适用于本标准。犘 犆 犚犘 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲犆 犺 犪 犻 狀犚 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀聚合酶链式反应。犇 犖 犃犇 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犻 犮犪 犮 犻 犱脱氧核糖核酸。犱 犖 犜 犘犇 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狅 狊 犻 犱 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧核苷三磷酸。犫 狆 犫 犪 狊 犲狆 犪 犻 狉碱基对。犜 犪 狇酶 聚合酶。犈 犅溴化乙锭。原理黑麦草腥黑穗病菌（犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪狑 犪 犾 犽 犲 狉 犻 ）属真菌界（），担子菌
4、门（），黑粉菌纲（），黑粉菌目（），腥黑粉菌科（），腥黑粉菌属（犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪）。被侵染的植株结实时，种子被病菌冬孢子侵占，形成菌瘿。冬孢子形态学特征和 反应特性是鉴定该种病原菌的依据。地理分布和寄主范围参见附录。仪器设备 多功能显微镜。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 体视显微镜。低速离心机。往复式振荡器。干热灭菌器。高压灭菌器。仪。凝胶成像系统。实时荧光 仪。生物培养箱。可调微量加样器（）。载玻片（长宽为 ，厚）。盖玻片（）。网筛（孔径 和）。药品试剂 次氯酸钠溶液或漂白粉精片（化学纯）。吐温 （）。席尔氏浮载剂（见 附录）。无荧光显微镜物镜镜头浸泡油（）。溴化
5、乙锭（）。封片剂：指甲油或阿拉伯树胶。琼脂糖。蛋白酶。酶。（，）。（）。无水乙醇。酚。三氯甲烷。异丙醇。异戊醇。犜 犪 狇 聚合酶。实验室检验 样品接收接收待检样品时，应核对记录，报检号、品名、批号、原产地、样品编号、送样员姓名、接样员姓名和接样日期。制备平均样品在样品预备室内将待检样品在样品袋内充分混匀，制成平均样品，每样。样品洗涤检验 取样从平均样品中称取 作为试验样品。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 洗涤离心试验样品倒入灭菌三角瓶内，加蒸馏水 ，再加吐温 滴滴，用铝铂纸或 膜封住三角烧瓶瓶口。将三角瓶放在往复式振荡器上振荡 ，洗涤液经过孔径 和 网筛过滤，用灭菌水冲洗孔径
6、网筛上的截留物，洗涤三次后将截留物转移至离心管内，离心 ，弃上清，取沉淀物。定容沉淀物中加入席尔氏浮载剂，定容至 。镜检用微量加样器吸取沉淀物悬浮液 至载玻片上，加盖玻片制片。在 显微镜下镜检，检查是否有表面呈疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子。每份试验样品的离心沉淀物至少检查张玻片，每片按视野依次全部检查。菌瘿检查镜检发现每个玻片超过 个具疣状突起孢壁纹饰的腥黑穗病菌冬孢子，将剩余平均样品倒入白瓷盘内，在充足光线下仔细检查有无菌瘿。受腥黑穗病菌侵染的种子被病菌穗状冬孢子代替而成为菌瘿，菌瘿位于子房内，外被一层不明显致密的寄主种皮，通常是部分受害，感染部分多数局限于种子的内稃一侧，外观症状不明显。冬孢
7、子堆暗褐色（茶褐色，咖啡色），无明显气味。冬孢子形态测量发现腥黑穗病菌菌瘿，直接挑取少许冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。未发现腥黑穗病菌菌瘿，显微镜或解剖镜下从洗涤液中挑取冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。显微镜下观察冬孢子形态特征并随机测量 个冬孢子的直径。每个成熟冬胞子按长短轴方向测量冬孢子直径大小，两者平均值为该冬孢子直径，并计算出 个冬孢子的平均直径。冬孢子转移和萌发如发现菌瘿，直接用菌瘿孢子萌发，从菌瘿中取少许冬孢子萌发，加入 灭菌水，制成孢子悬浮液，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至水琼脂平板上，连续光照条件下培养，培养后每天检查有无冬孢子萌发。如未发现菌瘿，中镜检发现
8、有孢壁纹饰为疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子，重新取样按 和 洗涤，用灭菌水悬浮沉淀物，取 沉淀物悬浮液在载玻片涂片，置显微镜 或解剖镜 下用细的挑针将冬孢子转移至无菌的塑料培养皿内的灭菌水中，挑取 个以上的冬孢子，然后在解剖镜下用 的次氯酸钠溶液 表面消毒 ，用移液器吸去次氯酸钠溶液，再用灭菌水洗涤三次，最后加入 灭菌水，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至水琼脂平板上，培养和检查方法同前。菌丝培养萌发的冬孢子转移至 培养基上 连续光照条件下培养，后收集菌丝。犇 犖 犃提取菌丝液氮研磨后取 提取 ，提取方法可以参见附录，也可用提取真菌或植物组织的 提取试剂盒。犘 犆 犚检测 菌丝培养物的犘 犆 犚
9、检测 引物和扩增扩增引物为 ，引物序列见附录，反应体系为：反应总体积为 ，包含：；（）；，浓度为 ；引物浓度 （引物 为 ）；模板 ：犜 犪 狇 聚合酶，设阳性、阴性和空白对照，阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝 ，阴性为小麦印犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售变腥黑穗病菌菌丝 ，空白对照为灭菌双蒸水代替 膜板。加双蒸水至终体积为，混匀离心，置于 仪进行扩增。反应循环参数为 ；，个循环；最后 。琼脂糖凝胶电泳取扩增产物，加入 上样缓冲液 溴酚蓝，（质量浓度）蔗糖水溶液，混匀，琼脂糖凝胶电泳。电泳，染色（或类似染料，比如 ）后于凝胶成像仪中成像存盘。冬孢子的犘 犆 犚检测 冬孢子的扩增前处理解
10、剖镜 下将单个冬孢子挑至已灭菌的盖玻片小块（）上，用另一块小玻片盖住冬孢子，用小镊子轻轻按压小玻片使孢子破裂，将两块小玻片连同破的孢子一起转移进 反应管中，加入 混和液，进行扩增。每个样品至少处理 个完整冬孢子，每个处理一个冬孢子。引物和扩增第一轮扩增引物为 和 ，引物序列见附录，引物比例为 和 ，反应体系和反应循环参数同 ，反应循环数为。设阳性、阴性和空白对照，阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝，阴性为小麦印度腥黑穗病菌菌丝，空白对照为灭菌双蒸水。取第一轮扩增产物为第二轮 反应的模板进行扩增，为第二轮 引物，反应体系和反应循环参数同 。实时荧光犘 犆 犚扩增同时取第一轮扩增产物为实时荧光 反应的模板
11、进行扩增，引物和探针序列见附录，实时荧光 扩增体系：缓冲液（），溶液（），（各 ），犜 犪 狇 聚合酶（），上、下游引物（和 ）（）各，探针（），模板，超纯水补至，设阳性、阴性和空白对照。实时荧光 扩增在 定量 扩增仪或其他实时荧光 扩增仪上进行。两步法扩增反应程序：，预变性 ；然后 ，循环 次。琼脂糖凝胶电泳电泳和观察结果同 。鉴定特征 冬孢子形态学特征冬孢子球形至近球形，浅黄至暗红褐色，不透明至半透明，（平均 ）。外胞壁具锥形至平截状突起，高，表面观为粗糙，不完全脑纹状至珊瑚状，外被透明至微黄褐色胶质鞘，延伸至突起顶部。黑麦草腥黑穗病菌和近似种冬孢子的形态特征比较见附录。冬孢子萌发生理特性
12、冬孢子 下培养 以后萌发，冬孢子萌发长出先菌丝，先菌丝上产生末端稍卷曲的丝状初生担孢子，数量 ，大小（）（），平均（）（），初生担孢子在 内萌发，强力弹射出腊肠状次生担孢子，次生担孢子可以萌发产生次生担孢子或菌丝，菌丝又可以产生丝状次生担孢子，在初生担孢子和次生担孢子彼此之间没有融合现象。腊肠状次生担孢子大小（）（），丝状次生担孢子大小（）（）。结果评定 发现菌瘿发现菌瘿，寄主为黑麦草属，冬孢子形态特征与 相符合，判定为黑麦草腥黑穗病菌。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 未发现菌瘿根据冬孢子形态特征不能鉴定以 扩增结果为准，菌丝的 、孢子的巢式 （）和实时荧光 试验中任何一个扩增试
13、验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。未发现菌瘿，根据冬孢子形态特征不能鉴定的视 扩增结果，菌丝的 、孢子的套式 （）和实时荧光 试验中任何一个扩增试验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。样品保存保存样品应按报检号、品种、批号分别存放，每样。保存样品经登记和经手人签字后置低温干燥、防虫防鼠处妥善保存个月。如发现病菌冬孢子，该样品至少保存 个月，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭菌处理。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犃（资料性附录）黑麦草腥黑穗病菌地理分布和寄主范围犃 地理分布美国、澳大利亚和新西兰等。犃 寄主范围黑麦草腥黑穗病菌只侵染黑麦草属。附录犅（资料性附录）菌丝犇
14、 犖 犃提取方法犅 离心收集菌丝，转移菌丝至研钵中，液氮冷冻，磨碎菌丝。犅 取 粉状菌丝转入小管，加 （，），加 蛋白酶，孵育，期间轻轻摇动混匀。犅 调节盐浓度至 ，加 体积 ，。犅 体积 （三氯甲烷异戊醇），轻摇混匀，孵育 ，离心 。犅 取 上 清 液 至 离 心 管，加 ，轻 摇 混 匀，置 ，离心 。犅 取上清液，加 酶，孵育 ，离心 。犅 取上清液，加 体积异丙醇沉淀，立即 离心 ，如无 团出现，立即置 。犅 弃上清液，冷 乙醇洗次，干燥后溶解于 中。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犆（规范性附录）扩增试验引物和探针引物编号核苷酸序列 位置产物 （）（）正义引物 。反义
15、引物 。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书犛 犖犜 附录犇（规范性附录）黑麦草腥黑穗病菌和近似种冬孢子的形态特征比较种名大小颜色形状刺状突起寄主犜狑 犪 犾 犽 犲 狉 犻黑 麦 草 腥 黑 穗病菌 平均 淡褐色至暗褐色，但不会呈不透明的黑色很规则球形剖面观常呈钝圆，表面观为脊状突起，有时和印腥相似黑麦草犜犻 狀 犱 犻 犮 犪小 麦 印 度 腥 黑 穗病菌 平均 褐 色 至 黑色，不透明球 形 至 亚球形浓密，表面观为疣状纹饰小麦犜犺 狅 狉 狉 犻 犱 犪水稻腥黑穗病菌 平均 褐 色 至 黑色，不透明球 形 至 亚球形可能弯曲，顶端常为较大的钝圆水稻犜犲 犺 狉 犺 犪 狉
16、 狋 犪 犲沙 地 牧 草 腥 黑 穗病菌 平均 浅 褐 色 至深褐色球 形 至 亚球形剖面观呈钝圆，表面观为脊状突起，排列规则沙地牧草犜犫 犪 狉 犮 犾 犪 狔 犪 狀 犪狼 尾 草 腥 黑 穗病菌 平均 浅 褐 色 至深褐色球 形 至 亚球形疣状突起短，垂直或略为倾斜着 生，基 部 呈 不 大 规 则 多角形狼尾草犜狊 犲 狋 犪 狉 犻 犪 犲狗尾草腥黑穗病菌 平均 浅 褐 色 至深褐色球 形 至 亚球形疣状突起低矮，垂直着生，基部呈规则五角或六角形，排列紧密狗尾草犜狅 狆 犪 犮 犪 平均 浅 褐 色 至深褐色球 形 至 亚球形疣状突起低矮，垂直着生，基部呈规则五角或六角形，排列紧密犛 狆 犿 犻 犳 犲 狓犾 犻 狋 狋 狅 狉 犲 犲 狌 狊犜狊 狌 犿 犪 狋 犻 犻苏 玛 特 腥 黑 穗病菌 平均 浅 褐 色 至深褐色球 形 至 亚球形疣状突起低矮，不明显，垂直或略为倾斜着生，基部呈多角形，排列紧密犆 狅 犾 狓犾 犪 犮 狉 狔 犼 狅 犫 犻犜狊 犪 狏 犻 犾 犲 犻 平均 浅 褐 色 至深褐色球 形 至 亚球形疣状突起明显，垂直着生，基部呈规则五角或六角形，排
