1、ICS 07.100.99 B 41 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 18502020 动物垫料中菌落总数检测 Detection for aerobic plate count in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 18502020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国呼和浩特海关、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人:赵治国、陈林军、敖威华、延涵、崔强、王海
2、艳、于志超、刘佳、任彩霞、刘来俊、张晓东、杨帆、陈少博。DB15/T 18502020 1 动物垫料中菌落总数检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中菌落总数的平板计数法。本标准适用于动物垫料中菌落总数的定量检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值得表示和判定 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2
3、培养基制备指南 第2部分:培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物,使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。3.2 菌落总数 aerobic plate count 检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后,所得每 g(cm2)检样中形成的需氧和兼性厌氧微生物菌落总数。3.3 菌落形成单位 colony forming unit(CFU)在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落,是计算细菌或霉菌数目的单位。4 设备和材料 4.1
4、恒温培养箱:36 1。4.2 冰箱:2 5。DB15/T 18502020 2 4.3 恒温水浴箱:46 1。4.4 天平:感量为 0.1 g。4.5 均质器。4.6 振荡器。4.7 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。4.8 无菌锥形瓶:250 mL、500 mL。4.9 无菌培养皿:直径 90 mm。4.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。4.11 放大镜或/和菌落计数器。4.12 无菌规格板:5 cm 5 cm。4.13 漩涡混合器。4.14 无菌量筒。4.15 无菌棉签。4.16 无菌镊子。4.17 无菌
5、剪刀。4.18 无菌滤膜均质袋。5 培养基和试剂 5.1 实验用水:符合 GB/T 6682 的要求。5.2 无菌生理盐水:见附录 A.2。5.3 磷酸盐缓冲液:见附录 A.3。5.4 平板计数琼脂培养基:见附录 A.4。6 操作步骤 6.1 采样 6.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序,防止一切可能的外来污染。6.1.2 颗粒状或粉末状样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g,充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末状垫料样品,加入225 mL无菌稀释液(磷酸盐缓冲液或生理盐水),充分振摇或均质1 min2 min,制成1:10的
6、样品匀液。DB15/T 18502020 3 6.1.3 平面样品 表1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于0.25(含)25 1 0.250.5(含)50 2 0.50.75(含)75 3 大于0.75 100 4 稀释无菌操作将灭菌规格板(5 cm5 cm)放在平面垫料表面,用浸有无菌稀释液(磷酸缓冲液或生理盐水)的棉拭子,在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次,并随之转动棉拭子,然后用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分,将棉拭子头置入装有 25 mL 无菌稀释液的无菌锥形瓶中,根据样品面积大小重复采样 14 个规格板面积,采样量见表 1,相应地将棉
7、拭子头置入 25 mL100 mL 的无菌稀释液中,充分振摇制成样品原液(1 mL 原液对应的样品面积为 1 cm2)。取 1 mL 样品原液注入含有 9 mL 无菌稀释液的试管中,制成 1:10 的样品匀液。6.2 稀释 6.2.1 取 1 mL 1:10 样品匀液注入含有 9 mL 无菌稀释液的试管中,另换一支 1 mL 无菌吸管反复吹吸,或在旋涡混合器上混匀,此液为 1:100 的样品匀液。6.2.2 按 6.2.1 操作,制备 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用 1 支 1 mL 无菌吸管。6.2.3 根据对垫料样品污染状况的估计,选择 23 个适宜稀释度的样品匀液,在
8、进行 10 倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液于 2 个无菌平皿内;同时分别取 1 mL 无菌稀释液加入 2个无菌平皿作空白对照。6.2.4 及时将 20 mL25 mL 冷却至 46 的平板计数琼脂培养基(可置于 46 1 恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。6.2.5 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层平板计数琼脂培养基(约 4 mL),凝固后翻转平板,再进行培养。6.3 培养 琼脂凝固后倒置平板,置36 1 培养箱中培养48 h2 h,观察并计数结果。6.4 菌落计数 6.4
9、.1 用肉眼观察,必要时可用放大镜或低倍镜,记录稀释倍数和相应的菌落总数。以菌落形成单位(colony-forming units,CFU)表示。6.4.2 选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数,大于 300 CFU 的可记录为多不可计。6.4.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计数半个平板菌落数后乘以 2,代表该平板菌落数。6.4.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条
10、单链作为一个菌落计数。DB15/T 18502020 4 7 结果与报告 7.1 结果 7.1.1 若只有一个稀释度的两个平板菌落数在 30 CFU300 CFU 时,计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数。7.1.2 若有两个稀释度平板上菌落数均在 30 CFU300 CFU 时,按以下公式(1)计算:dnnCN)1.0(21 (1)式中:N 样品中菌落总数;C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)。7.1.3 若所有平板上菌落数均大于 300 CFU,
11、则对稀释度最高的平板进行计数,其它平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4 若所有平板上菌落数均小于 30 CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间,其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时,则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算,同时应选取稀释倍数较低的平均菌落数进行计算。7.2 报告 7.2.1 菌落数按“四舍五入”原则修约
12、。菌落数在 10 CFU 以内时,采用一位有效数字报告;菌落数在 10 CFU100 CFU 之间时,采用两位有效数字报告。7.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时,第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前 2 位数字,后面用 0 代替位数来表示结果;也可用 10 的指数形式来表示,此时也按“四舍五入”原则修约,采用两位有效数字。具体修约规则按照 GB/T 8170 执行。7.2.3 若空白对照平板上有菌落出现,则此次检测结果无效。7.2.4 以 CFU/g 或 CFU/cm2为单位报告菌落总数。DB15/T 18502020 5 A A 附 录 A(规范性附录)培养基和试剂 A
13、.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行,并对制备好的培养基进行性能测试,如使用等效的脱水合成培养基,使用前对其进行验收并按其说明书使用。A.2 生理盐水 A.2.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 氯化钠加入1000 mL蒸馏水中,搅拌至完全溶解,分装后,121 灭菌15 min,备用。A.3 磷酸盐缓冲液 A.3.1 成分 磷酸二氢钾 34.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.20.1,用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1000 mL,分装于适宜容器中,121 高压灭菌15 min。A.4 平板计数琼脂培养基 A.4.1 成分 胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL DB15/T 18502020 6 A.4.2 制法 上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,调至pH至7.00.2。分装后,121 灭菌15 min,备用。_