1、 ICS 65.020.01 B 04 天津市地方标准 DB12DB12/T 5042014 水稻转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified rice 2014-04-22 发布 2014-07-20 实施天津市质量技术监督局发布天津市质量技术监督局发布 DB12/T 5042014 1 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由天津市质量技术监督局提出。本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。本标准主要起草人：黄凤军、朱珠、易萌、杨炳存、刘文、赵新、李阳、闫荣卿
2、。本标准 2014 年 04 月首次发布。DB12/T 5042014 1 水稻转基因成分筛查方法 1 范围 本标准规定了水稻中转基因成分定性 PCR 筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于水稻及其制品中 SPS 基因、CaMV35S 启动子、NOS 终止子、Bt 基因、NPTII 基因和HPT 基因的定性 PCR 筛查检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物
3、及其产品检测 通用要求 农业部 1485 号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部 2031 号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 SPS 基因基因 SPS gene 编码蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase）的基因。3.2 CaMV 35S 启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus（CaMV）来自花椰菜花叶病毒的 35S 启动子。3.3 NOS 终止子 terminator of nopaline synthase（
4、NOS）gene 来自胭脂碱合成酶基因 NOS 的终止子。3.4 Bt 基因 Bt（Bacillus thuringiensis）gene 来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。3.5 NPTII 基因基因 NPTII gene 来源于大肠杆菌（Escherichia coli），编码新霉素磷酸转移酶（neomycin phosphotransferase）的基因。3.6 HPT 基因基因 HPT gene 来自大肠杆菌或链球菌（Str
5、eptomyceshy groscopicus），编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）的基因。DB12/T 5042014 2 4 检测方法 4.1 试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。4.1.2 琼脂糖。4.1.3 10 g/L 溴化乙锭溶液：称取 1.0 g 溴化乙锭（EB），溶于 100 mL 水中，避光保存。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。4.1.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后再加
6、水定容到 200 mL。4.1.5 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入 70 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（4.1.4）调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。4.1.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.
7、4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。4.1.7 TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和 2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。4.1.8 50TAE 缓冲液：称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用 300 mL 水加热搅拌溶解后，加 100 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。4.1.9 加样缓冲液：称取 250.0 m
8、g 溴酚蓝，加 10 mL 水，在室温下溶解 12 h；称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝，用 10 mL 水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，用 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4 下保存。4.1.10 DNA 分子量标准：可以清楚的区分 50 bp1 000 bp 的 DNA 片段。4.1.11 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。4.1.12 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。4.1.13 引物引物：水稻内标准基因和
9、转基因水稻外源基因检测时所用的引物序列见表 1。表 1 水稻内标准基因和转基因水稻外源基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 SPS SPS-F：5-ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC-3 SPS-R：5-GCCATGGATTACATATGGCAAGA-3 287 bp 内标准基因 CaMV 35S 35S-F：5-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 35S-R：5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 195 bp 外源基因 NOS NOS-F：5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 NOS-R：5-TTATCC
10、TAGTTTGCGCGCTA-3 180 bp 外源基因 Bt Bt-F：5-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3 Bt-R：5-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3 301 bp 外源基因 NPTII Npt-F：5-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3 Npt-R：5-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3 289 bp 外源基因 HPT hpt-F：5-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-3 hpt-R：5-AGATGTTGGCGACCTCGTATT-3 472 bp 外源基因 DB12/T 5042014 3 4.1.14 引物溶液：
11、用 TE 缓冲液（4.1.7）或水分别将上述引物稀释到 10 mol/L。4.1.15 石蜡油石蜡油。4.1.16 PCR 产物回收试剂盒。4.1.17 DNA 提取试剂盒。4.2 仪器 4.2.1 分析天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。4.2.2 PCR 扩增仪：升降温速度1.5/s，孔间温度差异1.0。4.2.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。4.2.4 紫外透射仪。4.2.5 凝胶成像系统或照相系统。4.2.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。4.2.7 其他相关仪器设备。4.3 分析步骤 4.3.1 抽样 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定的执行。4.3.2
12、 试样准备 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定的执行。4.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。4.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。4.3.5 PCR 反应 4.3.5.1 试样 PCR 反应 4.3.5.1.1 每个试样 PCR 反应设置 3 次重复。4.3.5.1.2 在 PCR 反应管中按表 2 依次加入反应试剂，混匀，再加 25 L 石蜡油（有热盖设备的 PCR仪可不加）。表 2 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L
13、 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L）各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L 正向引物 0.20.5 mol/L 0.52.5L DB12/T 5042014 4 10 mol/L 反向引物 0.20.5mol/L 0.52.5L Taq 酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 根据 Taq 酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积水。注：SPS 基因 PCR 检测反
14、应体系中，上下游引物分别是 SPS-F1 和 SPS-R，引物终浓度分别为 0.2mol/L；CaMV35S 启动子 PCR 检测反应体系中，上下游引物分别是 35S-F 和 35S-R，引物终浓度分别为 0.4mol/L；NOS终止子 PCR 检测反应体系中，上下游引物分别是 NOS-F 和 NOS-R，引物终浓度分别为 0.4mol/L；Bt 基因 PCR检测反应体系中，上下游引物分别是 Bt-F 和 Bt-R，引物终浓度分别为 0.5mol/L；NPTII 基因 PCR 检测反应体系中，上下游引物分别是 Npt-F 和 Npt-R，引物终浓度分别为 0.2mol/L；HPT 基因 PCR
15、 检测反应体系中，上下游引物分别是 hpt-F 和 hpt-R，引物终浓度分别为 0.2mol/L。4.3.5.1.3 将 PCR 管放在离心机上，500 g3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 扩增仪中。4.3.5.1.4 进行 PCR 反应。反应程序按表 3 进行。表 3 PCR 反应程序 被扩增的基因 变性 扩增 循环次数 最终延伸 SPS 94，5 min 94，30s 58，30s 72，30s 35 72，2 min CaMV35S 94，5 min 94，30 s 60，30 s 72，30 s 35 72，7 min NOS 94，5 min 94
16、，30 s 60，30 s 72，30 s 35 72，7 min Bt 95，5 min 94，1 min 56，30 s 72，30 s 35 72，7 min NPTII 94，5 min 94，30 s 60，30 s 72，30 s 35 72，7 min HPT 94，5 min 94，30 s 60，30 s 72，30 s 35 72，7 min 4.3.5.1.5 反应结束后取出 PCR 管，对 PCR 反应产物进行电泳检测。4.3.5.2 对照 PCR 反应 在试样 PCR 反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因水稻基因组 DNA 作为阴性对照；以含有 SPS、CaMV35S、NOS、Bt、NPTII、HPT 基因的转基因水稻质量分数为 0.1%1.0%的基因组 DNA 作为阳性对照；以水作为空白对照。DB12/T 5042014 5 各对照 PCR 反应体系中，除模板外，其余组分及 PCR 反应条件与 7.5.1 相同。4.3.6 PCR 产物电泳检测 按 20 g/L 的质量浓度称量琼脂糖，加入 1TAE 缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液
