1、 ICS 67.050 B 45 天津市地方标准 DB12 DB12/T 6532016 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光 PCR 法 Quantitative PCR method for animal derived materials in meat and meat products 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会发布天津市市场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 6532016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准
2、与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。本标准 2016 年 9 月首次发布。DB12/T 6532016 1 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了鲜冻畜、禽肉中动物源性成分（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）的定量 PCR 检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量 PCR 检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本
3、（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 实时荧光 PCR real time PCR 实时荧光 PCR 是指 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个 PCR 过程，对未知模板进行定性或定量分析。3.2 Ct 值 cycle time 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3 内参基因 reference gene 能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）。3.4 牛源性成分 bovine-derived materials 牛种属特异
4、性 DNA 片段。3.5 羊源性成分 ovine-derived materials 羊种属特异性 DNA 片段。3.6 猪源性成分 porcine-derived materials 猪种属特异性 DNA 片段。3.7 鸡源性成分 chicken-derived materials 鸡种属特异性 DNA 片段。3.8 鸭源性成分 duck-derived materials 鸭种属特异性 DNA 片段。DB12/T 6532016 2 4 原理 根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的 DNA 特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异性区域设计五对种属特异性引物，通用引物可同时扩增牛、羊、猪、
5、鸡、鸭等多种动物源性 DNA，采用 TaqMan 实时荧光 PCR 技术，根据标准参照物模板含量与 Ct 值间的线性关系，绘制标准曲线，计算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。5 检测方法 5.1 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。5.1.1 DNA 提取用试剂 三氯甲烷；异戊醇；乙酸钠；无水乙醇；Tris 饱和酚；裂解液：10 mmoL/L Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH8.0），5 g/L SDS，0.1 g/L蛋白酶K；TE 缓冲液（Tris-
6、HCl、EDTA 缓冲液）：10 mmoL/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。5.1.2 TaqMan 荧光 PCR 反应试剂盒 5.1.3 引物和探针。表 1 动物源性成分内参基因和种属特异性基因引物和探针序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 16SrDNA 16S-F：5-ACCGTGCAAAGGTAGCATAATCA-3 16S-R：5-GCTCCATAGGGTCTTCTCGTCTT-3 16S-P：5-FAM-ACTTGTATGAATGGCCGCACGAGGGTT-TAMRA-3 82 bp 内参基因 Rd1 Rd1-F：5-G
7、TAGGTGCACAGTACGTTCTGAAG-3 Rd1-R：5-GGCCAGACTGGGCACATG-3 Rd1-P：5-FAM-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-BHQ1-3 95 bp 牛源基因 OA-PRLP OA-F：5-CCAACATGCCTTTAAACCCTCAA-3 OA-R：5-GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG-3 OA-P：5-FAM-GAGACTGGCGGGGAAGGAAAGGCA-TAMRA-3 88 bp 羊源基因 Sus-ACTB Sus-F：5-GGAGTGTGTATCCCGTAGGTG-3 Sus-R：5-CTGGGGACATGC
8、AGAGAGTG-3 Sus-P：5-FAM-TCTGACGTGACTCCCCGACCTGG-BHQ1-3 103 bp 猪源基因 Chk Chk-F：5-CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT-3 Chk-R：5-GTCATAGCGGAACCGTGGATA-3 Chk-P：5-FAM-CTATGAATCCGGGCCTC-TAMRA-3 62 bp 鸡源基因 Duc Duck-F：5-AAGCCTTCCTCTAGCTCAGC-3 Duck-R：5-AGAAAATGCTTTAGTTAAGTC-3 Duck-P：5-FAM-CTCAGCCGCTTAAACAACGC-TAMRA-3 80 bp
9、鸭源基因 用水分别将上述引物和探针稀释到 10 mol/L，探针需避光保存。预期扩增片段信息参见附录 A，TaqMan 探针引物其 5端标记荧光报告基团（如 FAM、ROX 等），3端标记对应的荧光淬灭基团（如TAMRA、BHQ1 等）。5.1.4 阳性对照 用已知含相应动物源性成分的样品作阳性对照。DB12/T 6532016 3 5.1.5 双蒸水。5.2 仪器 荧光定量 PCR 扩增仪；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；分析天平，感量 0.1 g 和 0.1 mg；离心机：离心力 12000 g；微量移液器：0.5L10L，10L100L，10L200L，100L1000L；实时荧光 PC
10、R 反应管；重蒸馏水发生器或纯水仪；恒温水浴箱。5.3 分析步骤 5.3.1 试样制备 生鲜肉直接进行试样制备，冷冻肉于室温融化后进行制样。充分混匀，用四分法缩分出不少于 500 g 作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于-20冷冻保存。5.3.2 DNA 提取 取待测样本剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，液氮预冷后放入研钵中，然后缓慢向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取 100 mg 加入 2 mL 灭菌离心管中；加入 500 L 10%SDS 裂解液和 20 L 蛋白酶 K（20 mg/mL），混匀，55水浴消化数小时，期间不停颠倒混匀，直至溶液透明；将消
11、化后的组织裂解液加入等体积的 Tris 饱和酚，缓慢颠倒混匀，12000 rpm 离心 10 min，转移上清至一新离心管，重复 1 次；加入 0.5 倍体积的 Tris 饱和酚和 0.5 倍体积的氯仿/异戊醇（24:1），缓慢颠倒混匀，12000 rpm 离心 10 min，转移上清至一新离心管；加入 0.1 倍体积的乙酸钠溶液和 2.5倍体积 4预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，可见白色 DNA 絮状沉淀析出，-20 沉淀 2 h；12000 rpm离心 5 min，加入 500 L 70%乙醇洗涤沉淀；室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入 100 L TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀。5.3.3
12、 标准曲线样品制备 采用牛、羊、猪、鸡、鸭相应的标准品绘制种属特异性基因和 16SrDNA 内参基因的标准曲线。提取动物源性成分标准物质基因组 DNA，用 0.1TE 或水稀释梯度稀释，标准溶液至少涵盖 5 个动物源性成分浓度梯度。5.3.4 PCR 反应 5.3.4.1 标准样品和试样实时荧光 PCR 反应 同时进行标准样品和试样的 PCR 反应，每个 PCR 反应设置 3 次平行。动物源性成分种属特异性基因实时荧光 PCR 反应按表 2 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂，混匀；16SrDNA 内参基因实时荧光 PCR 反应按表 3 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂，混匀。将 PCR
13、 管放在离心机上，500 g3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。运行实时荧光 PCR 反应。反应程序为：95变性 2 min；进行 45 次循环扩增反应（95变性 15 s，60退火延伸 1 min）；在第二阶段的退火延伸（60）时段收集荧光信号。DB12/T 6532016 4 表 2 动物源性成分种属特异性基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L 正向引物 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L 反向引物 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L 探针引物 0.4 mol/L 1.0
14、L DNA 模板 1.0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。表 3 16SrDNA 内参基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L 16S-F 0.4 mol/L 1.0 L 10 mol/L 16S-R 0.4 mol/L 1.0 L 10 mol/L 16S-P 0.2 mol/L 0.5 L DNA 模板 1.0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。
15、“”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。5.3.4.2 设置对照 应设置阴性对照和空白对照。以鲑鱼精子 DNA 作为阴性对照 PCR 反应体系的模板用纯水作为空白对照 PCR 反应体系的模板。各对照 PCR 反应体系中，除模板外其余组分及 PCR 反应条件与 5.3.4.1相同。5.3.5 数据分析 5.3.5.1 设定阈值 实时荧光 PCR 反应结束后，以 PCR 刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好
16、。5.3.5.2 记录 Ct 值 设定阈值后，荧光定量 PCR 仪的数据分析软件自动计算每个反应的 Ct 值，并记录。5.3.5.3 绘制标准曲线 根据标准溶液的扩增 Ct 值和初始模板含量的对数间的线性关系，分别绘制动物源性成分种属特异性基因和 16SrDNA 内参基因的标准曲线。DB12/T 6532016 5 标准曲线公式：式中：y测试样品的 Ct 值；a标准曲线的斜率；x模板靶标浓度以 10 为底数的对数；b标准曲线的截距。5.3.5.4 数据可接受的标准 动物源性成分种属特异性基因阴性对照和空白对照的 Ct 值38；16SrDNA 阴性对照和空白对照的 16SrDNA 内标基因 Ct 值38；标准曲线的 R20.98，标准曲线斜率-3.6 且-3.1，满足上述条件，可以进行结果计算。否则重新进行实时荧光 PCR 扩增。5.3.5.5 含量计算 5.3.5.5.1 计算试样模板靶标浓度 将试样的动物源性成分种属特异性基因和 16SrDNA 内参基因的 Ct 值分别带入动物源性成分种属特异性基因和 16SrDNA 内参基因的标准曲线方程，计算动物源性成分种属特异性基因和 16Sr
