1、ICS 67 X 04 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 5189.82020 天然植物提取物中危害成分检测 第 8 部分：辣椒提取物中苏丹红的测定 2020-06-28 发布 2020-07-28 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB13/T 5189.82020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。DB13/T 5189天然植物提取物中危害成分的测定共分12个部分：第 1 部分：亚硝酸盐的测定；第 2 部分：二氧化硫的测定；第 3 部分：正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇和乙醇 5 种有机溶剂残留的测定；第 4 部分：辣椒提取物中砷、铅、镉、铬、汞的测定；
2、第 5 部分：万寿菊提取物中对氧基苯胺的测定；第 6 部分：万寿菊提取物中乙氧基喹啉的测定；第 7 部分：天然番茄红中苯并 芘的测定；第 8 部分：辣椒提取物中苏丹红的测定；第 9 部分：辣椒提取物中叔丁基对苯二酚的测定；第 10 部分：辣椒红中赭曲霉毒素 A 的测定；第 11 部分：叶黄素中苯的测定；第 12 部分：甜菊糖苷中邻苯二甲酸酯的测定。本部分为DB13/T 5189的第8部分。本标准由河北省市场监督管理局提出并归口。本部分起草单位：晨光生物科技集团股份有限公司、河北省食品检验研究院、石家庄海关技术中心、清河食品药品检验所。本部分主要起草人：连运河、张玉芬、史国华、杨清山、钱建瑞、艾
3、连峰、郭焕君。DB13/T 5189.82020 1 天然植物提取物中危害成分检测 第 8 部分：辣椒提取物中苏丹红的测定 1 范围 本部分规定了辣椒提取物中苏丹红、和的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。本部分适用于辣椒提取物中苏丹红、和的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理 辣椒提取物中的苏丹红经环己烷乙酸乙酯溶解，凝胶色谱净化，再浓缩至干，用乙腈复溶，采用C18（2.1 mm 50 mm，1
4、.7 m）色谱柱，以乙腈（0.1%）+甲酸水（0.1%）为流动相体系，梯度洗脱，三重四级杆质谱仪检测，外标法定量。4 试剂或材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 试剂 4.1.1 甲酸（C2H2O2）：优级纯。4.1.2 乙腈（C2H3N）：色谱纯。4.1.3 环己烷（C6H12）。4.1.4 乙酸乙酯（C4H8O2）。4.1.5 三氯甲烷（CHCl3）。4.2 试剂配制 环己烷乙酸乙酯：1+1（体积比）：量取500 mL环己烷与500 mL乙酸乙酯混合均匀。4.3 标准品 4.3.1 苏丹红标准品（C16H12N2O，CAS 号：842-0
5、7-9）：纯度大于 99.0%，或具有标准物质证书，20 常温储藏。DB13/T 5189.82020 2 4.3.2 苏丹红标准品（C18H18N2O，CAS 号：3118-97-6）：纯度大于 99.0%，或具有标准物质证书，20 常温储藏。4.3.3 苏丹红标准品（C22H16N4O，CAS 号：85-86-9）：纯度大于 99.0%，或具有标准物质证书，20 常温储藏。4.3.4 苏丹红标准品（C24H20N4O，CAS 号：85-83-6）：纯度大于 99.0%，或具有标准物质证书，20 常温储藏。4.4 标准溶液配制 4.4.1 混合标准储备液（100 mg/L）：称取苏丹红、苏丹
6、红、苏丹红和苏丹红标准品各 10 mg（精确至 0.01 mg），加入 5 mL 三氯甲烷促溶，用乙腈定容至 100 mL，配制成 100 mg/L 的储备液，于4 冰箱中冷藏保存。4.4.2 混合标准中间溶液（1 mg/L）：准确量取 100 mg/L 标准储备液 1 mL 至 100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，充分摇匀，得到浓度为 1 mg/L 的标准中间溶液。4.4.3 混合标准使用溶液：准确量取 1 mg/L 标准中间溶液 0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL至 100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，充分摇匀，得到浓度为 1 g/L、5 g/
7、L、10 g/L、20 g/L、50 g/L、100 g/L 的系列标准使用液。5 仪器和设备 5.1 超高效液相质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.2 电子天平：感量为 0.1 mg 和 0.01 mg。5.3 漩涡混匀器。5.4 凝胶净化色谱仪（GPC）。6 试验步骤 6.1 试样提取 称取样品0.1 g（精确至0.1 mg）于25 mL容量瓶中，加入环己烷乙酸乙酯：1+1（体积比）定容，超声溶解，摇匀。上清液过0.45 m有机滤膜后作待净化液。6.2 试样净化 取待净化液于GPC样品管中，进行GPC净化，进样量5 mL，收集洗脱液，于40 下旋转蒸发至干。残渣用2 mL乙腈超声溶解，过
8、0.22 m有机滤膜，待测。凝胶渗透色谱净化参考条件如下：a)凝胶渗透色谱净化系统；b)凝胶柱规格 400 mm 25 mm（内径）；c)色谱柱填料 Bio-Beads S-X3（3875 m），50 g；d)流动相：环己烷乙酸乙酯：1+1（体积比）；e)流速：5 mL/min；DB13/T 5189.82020 3 f)收集时间：2537 min（具体时间以实际标样为准）。6.3 色谱质谱参考条件 6.3.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下：a)色谱柱：C18 色谱柱（2.1 mm 50 mm，1.7 m），或性能相当者；b)流动相：A 0.1%甲酸乙腈，B 0.1%甲酸水溶液，线性梯度洗脱
9、条件见表 1；c)流速：0.35 mL/min；d)柱温：35；e)进样量：10 L。表1 梯度洗脱条件 时间（min）A(%)B（%）0.0 70 30 0.5 70 30 1 80 20 5.5 80 20 5.6 100 0 7 100 0 7.1 70 30 8 70 30 6.3.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下：a)电离方式：ESI+；b)离子源温度 120；c)脱溶剂温度 420；d)毛细管电压 1.0 kv，；e)脱溶剂气体流速 700 L/h；f)碰撞气体流速 0.27 mL/min；定性定量离子、碰撞电压、驻留时间见表2。表2 定性定量离子、碰撞电压、驻留时间 化合物 母
10、离子 子离子 锥孔电压V 碰撞电压V 驻留时间（s）苏丹红 249.2 93.1 35 25 0.350 156.1 35 25 0.350 苏丹红 277.2 121.1 25 20 0.450 156.1 25 20 0.450 苏丹红 353.2 77 35 25 0.450 197.1 35 25 0.450 苏丹红 381.2 91.1 27 20 0.350 224.2 27 20 0.350 DB13/T 5189.82020 4 6.4 测定 6.4.1 定性 按照液相色谱质谱/质谱条件测定样液和标准工作溶液，外标标准曲线法测定样液中苏丹红的含量。样品中待测物含量应在标准曲线范
11、围之内，如果含量超出标准曲线范围，应用空白溶剂进行适当稀释。在上述色谱条件下，苏丹红的质量色谱峰保留时间分别约为1.4 min、2.1 min、2.7 min、4.6 min。在相同试验条件下，样品与标准工作液中待测物质的质量色谱峰相对保留时间在2.5%以内，并且在扣除背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。四种苏丹红的液相色谱-质谱总离子流图见附录A。表3 使用液相色谱质谱/质谱定性时相对离子丰度最大允许误差 相对丰度（基峰）/%相对离子丰度最大允许误差/%50 20 大于20至小于等于50 25 大
12、于10至小于等于20 30 小于等于10 50 6.4.2 定量 以标准样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，从标准曲线图中查出试样溶液中苏丹红的相应含量。7 试验结果 辣椒提取物中苏丹红（苏丹红、苏丹红、苏丹红和苏丹红）含量X 按式（1）计算。c VXM（1）式中：X辣椒提取物中苏丹红的含量，单位为微克每千克（g/kg）；c从标准工作曲线查出的试样溶液中苏丹红的浓度，单位为微克每升（g/L）；V样品的最终稀释体积，单位为毫升（mL）；M试样质量，单位为克（g）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留至小数点后一位。8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的35%。9 检出限和定量限 检出限为0.1 mg/kg，定量限为0.3 mg/kg。DB13/T 5189.82020 5 A A 附 录 A（资料性附录）四种苏丹红的液相色谱-质谱总离子流图 四种苏丹红的液相色谱-质谱总离子流图，如图 A.1 所示。图 A.1 四种苏丹红的液相色谱-质谱总离子流图 _ 苏丹红4 苏丹红3 苏丹红2 苏丹红1
