1、B 04 ICS 65.020.01 天津市地方标准 DB12DB12/T 5062014 大豆转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified soybean 2014-04-22 发布 2014-07-20 实施天津市质量技术监督局发布 天津市质量技术监督局发布 DB12/T 5062014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由天津市质量技术监督局提出。本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。本标准主要起草人：黄凤军、陈杰、朱珠、李建、马强、赵新、龙起成、
2、陈慧。本标准 2014 年 04 月首次发布。DB12/T 5062014 1 大豆转基因成分筛查方法 1 范围 本标准规定了大豆中转基因成分定性 PCR 筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于大豆及其制品中 Lectin 内标准基因、CaMV35S 启动子、NOS 终止子、CP4-epsps 基因、Bt 基因和 bar/pat 基因的定性 PCR 筛查检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验
3、方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 农业部 2031 号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 农业部 1485 号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 Lectin 基因 Lectin gene 编码大豆凝集素的基因。3.2 CaMV 35S 启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus（CaMV）来自花椰菜花叶病毒的 35S 启动子。3.3 NOS 终止子 terminator of nopaline synthase（NOS）gene
4、 来自胭脂碱合成酶基因 NOS 的终止子。3.4 CP4-epsps 基因 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene derived from Agrobacterium sp.CP-4。来源于土壤农杆菌株系（Agrobacterium sp.）CP4 株系一段可编码 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的基因。3.5 Bt 基因 Bt（Bacillus thuringiensis）gene 来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry
5、1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。3.6 bar/pat 基因 bialaphos resistance gene/phosphinothricin acetyltransferase gene DB12/T 5062014 2 bar 基因来源于土壤吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus），pat 基因来源于绿产色链霉菌（Streptomyces viridochromogens），均编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinthricin acetyltransferase，PAT），该酶具有对除草剂草丁膦（glufosinate）的耐受性。bar 基
6、因和 pat 基因具有较高的同源性。4 检测方法 4.1 试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。4.1.2 琼脂糖。4.1.3 10 g/L 溴化乙锭溶液：称取 1.0 g 溴化乙锭（EB），溶于 100 mL 水中，避光保存。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。4.1.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到 200 mL。4.1.5 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二铵四乙酸二钠（ED
7、TA-Na2），加入 70 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（4.1.4）调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。4.1.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。4.1.7 TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（
8、4.1.6）和 2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。4.1.8 50TAE 缓冲液：称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用 300 mL 水加热搅拌溶解后，加 100 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。4.1.9 加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加 10 mL 水，在室温下溶解 12 h；称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝，用 10 mL 水溶解；称取 50.0 g
9、蔗糖，用 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4 下保存。4.1.10 DNA 分子量标准：可以清楚的区分 50 bp1 000 bp 的 DNA 片段。4.1.11 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。4.1.12 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。4.1.13 引物引物：大豆内标准基因和转基因大豆外源基因检测时所用的引物序列见表 1。表 1 大豆内标准基因和转基因大豆外源基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因
10、性质 Lectin lec-1672F：5-GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG-3 lec-1881R：5-GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG-3 210 bp 内标准基因 CaMV 35S 35S-F：5-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 35S-R：5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 195 bp 外源基因 NOS NOS-F：5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 NOS-R：5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 180 bp 外源基因 DB12/T 5062014 3 CP4-epsps mCP4ES-F：5
11、-ACGGTGAYCGTCTTCCMGTTAC-3 mCP4ES-R：5-GAACAAGCARGGCMGCAACCA-3 333 bp 外源基因 Bt Bt-F：5-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3 Bt-R：5-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3 301 bp 外源基因 bar bar-F：5-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 bar-R：5-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 262 bp 外源基因 pat pat-F：5-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3 pat-R：5-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3 26
12、2 bp 外源基因 4.1.14 引物溶液：用 TE 缓冲液（4.1.7）或水分别将上述引物稀释到 10 mol/L。4.1.15 石蜡油石蜡油。4.1.16 PCR 产物回收试剂盒。4.1.17 DNA 提取试剂盒。4.2 仪器 4.2.1 分析天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。4.2.2 PCR 扩增仪：升降温速度1.5/s，孔间温度差异1.0。4.2.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。4.2.4 紫外透射仪。4.2.5 凝胶成像系统或照相系统。4.2.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。4.2.7 其他相关仪器设备。4.3 分析步骤 4.3.1 抽样 按 NY/T 672 和农业部 2031
13、 号公告192013 规定的执行。4.3.2 试样准备 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定的执行。4.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。4.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。4.3.5 PCR 反应 4.3.5.1 试样 PCR 反应 4.3.5.1.1 每个试样 PCR 反应设置 3 次重复。4.3.5.1.2 在 PCR 反应管中按表 2 依次加入反应试剂，混匀，再加 25 L 石蜡油（有热盖设备的 PCRDB12/T 5062014 4 仪可不加）。表 2 PCR 检测反应体系
14、试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L）各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L 上游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L 10 mol/L 下游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L Taq 酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 根据 Taq 酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不
15、加氯化镁溶液，加等体积水。注 1：大豆内标准基因 PCR 检测反应体系中，上下游引物分别为 lec-1672F 和 lec-1672R，引物终浓度分别为 0.2mol/L；CaMV35S 启动子 PCR 检测反应体系中，上下游引物分别是 35S-F 和 35S-R，引物终浓度分别为0.4mol/L；NOS终止子PCR检测反应体系中，上下游引物分别是NOS-F和NOS-R，引物终浓度分别为0.4mol/L；CP4-epsps基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是mCP4ES-F和mCP4ES-R，引物终浓度分别为0.2mol/L；Bt 基因 PCR 检测反应体系中，上下游引物分别是 Bt-F
16、 和 Bt-R，引物终浓度分别为 0.5mol/L；bar 基因和 pat基因复合 PCR 检测反应体系中，上游引物分别是 bar-F 和 pat-F，下游引物分别是 bar-R 和 pat-R，引物终浓度分别为 0.1mol/L。4.3.5.1.3 将 PCR 管放在离心机上，500 g3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 扩增仪中。4.3.5.1.4 进行 PCR 反应。反应程序按表 3 进行。表 3 PCR 反应程序 基因名称 变性 扩增 循环次数 最终延伸 Lectin 94，5 min 94，30 s 58，30 s 72，30 s 35 72，7 min CaMV35S 94，5 min 94，30 s 60，30 s 72，30 s 35 72，7 min NOS 94，5 min 94，30 s 60，30 s 72，30 s 35 72，7 min CP4-epsps 95，7 min 94，30 s 63，30 s 72，30 s 5 72，7 min DB12/T 5062014 5 94，30 s 60，30 s 72，30 s 3
