1、 ICS 11.220 B 41 备案号：56330-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 26292017 猪肠道微孢子虫检测 聚合酶链式反应（PCR）法 Detection method of polymerase chain reaction(PCR)of Enterocytozoon bieneusi in pigs 2017 06-12 发布 2017-08-12 实施吉林省质量技术监督局 发 布 DB22/T 26292017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标
2、准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：曹利利、郭衍冰、姚新华、苑淑贤、程荣华、姚琳、董航、邵洪泽。DB22/T 26292017 1 猪肠道微孢子虫检测 聚合酶链式反应（PCR）法 1 范围 本标准规定了猪肠道微孢子虫PCR检测方法的技术要求。本标准适用于猪肠道微孢子虫的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适
3、用于本文件 3.1 猪肠道微孢子病 Intestinal microsporidiosis of pig 由肠道微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)引起的猪的一种以腹泻为主要特征的人兽共患病。4 试剂、材料 4.1 试剂 除另有规定，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682的双重蒸馏水（ddH2O）。4.1.1 粪便 DNA 提取试剂盒 4.1.2 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）溶液（见附录 A.1）4.1.3 50TAE 电泳缓冲液（见附录 A.2）4.1.4 1.5%琼脂糖凝胶（见附录 A.3）4.1.5 上样缓冲液（见附录 A.4）4.1.6 10P
4、CR 缓冲液（见附录 A.5）4.1.7 200U 或 2U/L Taq DNA 聚合酶 4.1.8 10 mM dNTPs 4.1.9 标准分子量 DL 2000 Marker 4.1.10 1.4 g/mL CsCl 溶液（见附录 A.7）4.1.11 猪肠道微孢子虫阳性对照：肠道微孢子虫基因组 DNA（10ng/L）。4.1.12 4 条引物序列及浓度见表 1。DB22/T 26292017 2 表1 引物序列及浓度 引物 引物序列 使用浓度 nmol/L OUT-F 5-GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT-3 OUT-R 5-AATACAGGATCACTTGGATCCGT
5、-3 IN-F 5-AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG-3 IN-R 5-AATATCCCTAATACAGGATCACT-3 10 4.2 材料 4.2.1 离心管（15 mL、50 mL、1.5 mL）4.2.2 药品勺 4.2.3 称量纸 4.2.4 0.2 mL 薄壁 PCR 管 4.2.5 500 mL 量筒 4.2.6 500 mL 锥形瓶 4.2.7 吸头（10 L、200 L、1000 L）5 仪器设备 5.1 分析天平 5.2 PCR 扩增仪 5.3 台式低温高速离心机 5.4 核酸电泳仪 5.5 紫外凝胶成像仪 5.6 可调移液器（2 L、20 L、200 L、1
6、000 L）5.7 恒温水浴锅 6 试验步骤 6.1 粪便样品处理 采集腹泻猪新鲜粪便样品约30 g，立即放入无菌处理的50 mL离心管中，加入35 mL ddH2O混匀，漩涡震荡10 min，过300 目网筛；滤液转入50 mL离心管中，补充ddH2O至45 mL，室温1500 g离心10 min，弃上清；沉淀用25 mL ddH2O 重悬，加入25 mL CsCl(1.4 g/ml)溶液混匀，室温300 g离心15 min；吸取2 mL表层液体转入15 mL离心管中，加 ddH2O 至13 mL，平衡后室温1500 g离心10 min，弃上清；沉淀用100 L ddH2O 重悬，转入1.5
7、 mL离心管，4 保存备用。6.2 基因组 DNA 提取 6.2.1 样本 DNA 提取 用粪便DNA提取试剂盒提取上述样本DNA，操作方法按说明书进行。6.2.2 阳性样品 DNA 提取 DB22/T 26292017 3 用粪便DNA提取试剂盒提取猪肠道微孢子虫DNA，操作方法按说明书进行。6.2.3 阴性对照 DNA 提取 健康猪粪便的DNA，获取方法同待检样品的处理方法。6.3 空白对照 以ddH2O为模板，作空白对照。6.4 PCR 扩增 6.4.1 第一轮扩增体系与条件 第一轮扩增体系见表2。表2 第一轮 PCR 体系 成分 用量 10PCR 缓冲液 5 L dNTPs 1 L T
8、aq DNA聚合酶 1 L OUT-F 2 L OUT-R 2 L 模板 10 L ddH2O 29 L PCR扩增条件为：94 预变性5 min；94 变性45 s，55 复性45 s，72 延伸60 s，35个循环；72 延伸10 min；4 保存。6.4.2 第二轮扩增体系与条件 第二轮扩增体系见表3。表3 第二轮 PCR 体系 成分 用量 10PCR 缓冲液 5 L dNTPs 1 L Taq DNA聚合酶 1 L IN-F 2 L IN-R 2 L 模板 10 L ddH2O 29 L PCR扩增条件为：94 预变性5 min；94 变性45 s，55 复性45 s，72 延伸60
9、s，35个循环；72 延伸10 min；4 保存。DB22/T 26292017 4 6.5 电泳 制备1.5%琼脂糖凝胶板（见附录A.3）。取8 L第二轮 PCR产物，与2 L上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中，相同方法加入阳性、阴性和空白对照PCR产物，加入标准分子量DL 2000 DNA marker，在5 V/cm电压条件下电泳30 min。用紫外凝胶成像仪观察结果。7 结果判定 将电泳凝胶板置于紫外凝胶成像仪下观察、判断结果，当阳性对照出现392 bp扩增带，阴性和空白对照未出现目的带时，实验结果成立：被检样品出现392 bp扩增带为猪肠道微孢子虫检测阳性，未出现相应扩增带的
10、样品判为阴性（见附录B.1）。必要时，取PCR产物进行测序并分析，目标DNA序列见附录B.2。8 废弃物处理 检测过程中的废弃物及个人防护，应按GB 19489的规定执行。DB22/T 26292017 5 附 录 A（规范性附录）相关试剂配制 A.1 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 0.2 g ddH2O 加至20.0 mL A.2 50TAE 电泳缓冲液制备 A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液配制（pH 8.0）。二水乙二铵四乙酸二钠 18.6 g ddH2O 80.0 mL 氢氧化钠（1 mol/L NaOH）调pH 至8.0 ddH2O 加至100 mL A.2.2
11、50TAE电泳缓冲液配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris）242.0 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）100.0 mL ddH2O 加至1 000 mL 作电泳液使用时，用ddH2O进行50倍稀释。A.3 1.5%琼脂糖凝胶板制备 琼脂糖 1.5 g 50TAE 电泳缓冲液 2.0 mL ddH2O 98.0 mL 微波炉中完全融化，待冷却至5060 时，加溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A.4 上样缓冲液 溴酚蓝0.2 g，加10 mL ddH2O过夜溶解。50 g蔗糖加入50 mL ddH2O溶解后，移入
12、已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100 mL。A.5 10PCR扩增缓冲液 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）10.0 mL 1 mol/L KC1 50.0 mL Nonidet P40 8.0 mL DB22/T 26292017 6 1.5 mol/L MgCl2 1.0 mL ddH2O 加至100 mL A.6 虫体消化液 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）100.0 mL SDS 10 mg 1 mol/L NaCl 100.0 mL 100 mol/L EDTA 100.0 mL ddH2O 加至1L A.7 CsCl溶液(1.4 g/ml)CsCl
13、31.0 g ddH2O 50 mL DB22/T 26292017 7 A A 附 录 B（规范性附录）引物 B.1 PCR扩增结果 注：M：DL 2000标准分子量；1：阳性标准对照；2：检测出的阳性样本；3：阴性对照；4：空白对照。B.2 PCR产物测序结果 AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTGAATATCTATGGCTAGATAAAGTACAAGTCGTAACAAGGTTTCAGTTGGAGAACCAGC TGAAGGATCATTTTCAGTTTTTGGGGTGTGGGTATCGGAATGTGTGGTAGGTGATGTGTGTGTGTATGGGGGATGCCGAG GGCACCAGCGGTGCGGTGGTGTGTGCAGGCGTGAGAGTGTATCTGCAAGTGTGAGGGATGTGGGTGCAGCGAGTTAGAGG TGGTTCAATGTGGAATAGTGGGATTGGTACGTGATGGTTGGATGGGGGAATGATGTTTGTATGGGTGAGGAAAATCGGAG GTTGCGGTGCGAGCGGCAGTAGGGTGCCATCAAGAGGTGTATTTGGAAATATCCCTAATACAGGATCACT 注：下划线部分为第二轮PCR引物序列。_
