1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 1864.42022 家禽疫病诊断技术规程 第 4 部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法 Code for practice diagnostic techniques of poultry diseases series Part 4:Test method for ELISA detection of avian leukosis antigen 2022-05-26 发布 2022-07-26 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 1864.42022 I 目次 前言.II 引言.III 1
2、 范围.4 2 规范性引用文件.4 3 术语和定义.4 4 原理.4 5 试验条件.5 6 试剂或材料.5 7 仪器设备.5 8 样品.6 9 试验步骤.7 10 结果判定.7 11 生物安全措施.8 DB42/T 1864.42022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件DB42/T 1864家禽疫病诊断技术规程为系列标准。本部分为DB42/T 1864的第4部分。DB42/T 1864发布了以下部分：第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。第 2 部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测 第 3 部分：鸡沙门氏菌、
3、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。第 4 部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：汪宏才、罗青平、邵华斌、彭伏虎、温国元、王红琳、张蓉蓉、卢琴、罗玲、张腾飞、张文婷、商雨 本文件实施应用的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；对本规程的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电话：
4、027-87156122，邮箱：。DB42/T 1864.42022 III 引 言 近年来，我国高度重视动物传染病的预防和控制工作，在国务院颁布的国家中长期动物疫病防治规划（20122020年）中明确要求进一步做好种禽场疫病净化、加强疫病检测诊断能力建设。家禽及蛋制品产业链是湖北省的十大重点产业链之一，为了加快湖北省重点农业产业链建设，保证家禽养殖健康与食品安全，依据湖北省重点农业产业链实施方案，对影响家禽及蛋制品产业链的禽白血病、禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌等家禽重要疫病开展快速检测方法研究。为加快我省家禽疫病净化进程，提升疫病的监测、检测效率，促进我省家禽业持续健康发展，起草组围绕家禽疫病
5、防控的需要，研制了 家禽疫病诊断技术规程系列标准，拟由4个部分构成。第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽 J 亚群白血病病毒、马立克氏病病毒、网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。目的在于检测鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡肉及相关产品细菌性疾病的快速检测。第四部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。目的在
6、于检测种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原 ELISA 检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。DB42/T 1864.42022 4 家禽疫病诊断技术规程 第 4 部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法 1 范围 本文件规定了种鸡场禽白血病酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测方法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤及结果判定。本文件适用于种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原ELISA检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅
7、该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 26436 禽白血病诊断技术 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 NY/T 680 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 禽白血病病毒 avian leukosis virus,ALV 禽白血病病毒属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、反转录病毒属的一类病毒。ALV可分为AK 11个亚群，其中与鸡相关且需净化的亚群主要有A
8、亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群和K亚群6个外源性病毒。3.2 酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体反应的高度特异性与酶标记技术相结合，进行免疫反应的定性和定量检测方法。4 原理 本文件采用酶联免疫吸附法（ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性，将抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体吸附到固相载体的表面后，形成固相抗体。加入待测样本，孵育使待测样本中p27抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体-抗原复合物。加入兔抗p27蛋白多克隆抗体后，再加入辣根过DB42/T 1
9、864.42022 5 氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体形成复合物。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待测物中禽白血病病毒p27蛋白的量直接相关，因此可以根据颜色的深浅来进行定性或定量分析。5 试验条件 实验操作应在室温（1825）下进行。样品前处理应在二级生物安全柜中进行。6 试剂或材料 6.1 试剂配制 本方法试验用水应按照GB/T 6682中规定的二级水，所有实验用试剂均为分析纯。试剂配制按照GB/T 27403规定。6.2 试剂或材料 6.2.1 捕获抗体：抗禽白血病病毒 p27 蛋白单克隆抗体。将 ALV 病毒 p27 蛋白基因克隆至原核表达载体 pET28a，构建
10、 pET28a-P27 重组质粒，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导表达获得 p27蛋白。将纯化的 p27 蛋白作为免疫原，免疫 Balb/c 小鼠后，取脾细胞与 SP2/0 细胞融合，经过筛选和纯化后，注射小鼠腹腔，生产单克隆抗体。6.2.2 检测抗体：兔抗 p27 蛋白多克隆抗体。以纯化的 ALV 重组 p27 蛋白为免疫原，经背部皮下免疫体重约 2.5 Kg 的日本大耳白兔 3 次。首次将 p27 蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后，按 1.0 mg/只的剂量免疫。效价较高时心脏釆血，分离血清。经效价测定后，置于-20冰箱中，保存备用。6.2.3 阳性对照：禽白血病病毒感
11、染 DF1 细胞培养液。6.2.4 阴性对照：空白 DF1 细胞培养液。6.2.5 磷酸盐缓冲液（PBS）：氯化钠（NaCl）8 g，氯化钾（KCl）0.2 g，十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，加水至 1 000 mL，置 28保存备用。6.2.6 包被液：碳酸钠（Na2CO3）1.59 g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g，加水至 1000mL，置 28保存备用。6.2.7 封闭液：牛血清白蛋白（BSA）5 g，氯化钠（NaCl）8 g，氯化钾（KCl）0.2 g，十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）2.9 g，磷酸
12、二氢钾（KH2PO4）0.2 g，硫柳汞钠 0.2 g，加水至 1 000 mL，置 28保存备用。6.2.8 洗涤液：氯化钠（NaCl）8 g，氯化钾（KCl）0.2 g，十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，Tween-20 0.5 mL，加水至 1 000 mL，置 28保存备用。6.2.9 底物溶液：3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）显色液，置 28保存备用。6.2.10 终止液：商品化的终止液。6.2.11 细胞：商品化 DF1 细胞及培养基，按照 GB/T 26436 的方法进行细胞准备与培养基配制。7 仪器设备 7.1
13、酶标仪（含有 450 nm、630 nm、650 nm 滤光片）。7.2 单通道微量加样器（规格为 100 L 和 1 000 L）。7.3 多通道微量加样器（规格为 50 L、100 L、300 L 和 1 000 L）。DB42/T 1864.42022 6 7.4 恒温培养箱。7.5 离心机。8 样品 种蛋样品、胎粪样品处理后，可直接进行ELISA检测。精液样品、血浆样品样品按照GB/T 26436的规定接种DF1细胞，培养5天7天后，取上清液进行直接进行ELISA检测，或将细胞培养物冻融3次后检测。8.1 保存及运输 8.1.1 待检样品在 28保存不应超过 24 h。8.1.2-20
14、保存不超过三个月。8.1.3-80以下可长期保存。8.1.4 样品应置于低温、密封的容器内运输。8.2 处理 8.2.1 蛋清 8.2.1.1 将种蛋按照小头朝上进行摆放，用 75%酒精棉对小头蛋壳进行擦拭消毒。8.2.1.2 击破种蛋小头的蛋壳，用微量移液器吸取 500 L1000 L 蛋清，置于 1.5 mL 离心管中。8.2.1.3 将收集的蛋清置于-20冻融 23 次。8.2.1.4 试验时取 100 L 直接使用。8.2.2 精液 8.2.2.1 用含有双抗的 PBS 将精液进行 2050 倍稀释，3 000 r/min 离心 3 min，取上清接种 DF1 细胞。8.2.2.2 置
15、于 37培养箱中培养 2 h 后，吸去细胞生长液，加入细胞维持液，继续培养 5 天7 天。8.2.2.3 取细胞上清液 100 L 进行检测。8.2.3 血浆 8.2.3.1 将血浆样品接种已长满单层的 DF1 细胞培养板，置于 37含 5%二氧化碳的恒温培养箱中。8.2.3.2 吸去细胞生长液，PBS 洗涤三次，加入细胞维持液，继续培养。8.2.3.3 培养 5 天7 天后，离心后吸取上清液作为检测样品。8.2.3.4 试验时取 100L 直接使用。8.2.4 肛拭子 8.2.4.1 将棉拭子深入泄殖腔内 2 cm 至 3 cm，轻轻旋转 3 圈并沾取少量粪便。8.2.4.2 将棉拭子头一并
16、放入盛有 1.5 mLPBS 的无菌离心管中（含青霉素和链霉素各 1 000 IU/mL），盖上管盖并编号。8.2.4.3 10 000 r/min 离心 5 min 后取上清备用。8.2.4.4 试验时取 100 L 直接使用。DB42/T 1864.42022 7 8.2.5 胎粪 8.2.5.1 取雏鸡胎粪，放入盛有 1.5 mL PBS 的无菌离心管中。8.2.5.2 置于液氮中快速冻融 2 次或-20冻融 2 次，10 000 r/min 离心 5 min 后取上清备用。8.2.5.3 试验时取 100 L 直接使用。9 试验步骤 9.1 将禽白血病病毒 p27 蛋白单克隆抗体包被于 96 孔酶标板中，每孔 100 L，4 过夜，洗涤液洗板 3 次，每次 5 min。9.2 加入封闭液，每孔 300 L，37 温育 2 h，拍干。9.3 取出包被板，加入阳性对照、阴性对照各 2 孔，每孔 100 L。9.4 在其余各孔，分别加入 100 L 被检样品。9.5 盖上盖板或塑料贴封纸，轻微震荡后，置于 1825条件下孵育 40 min。9.6 弃去孔内液体，洗涤酶标板。如果检测样
