1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 24722015 H1N1 亚型不同谱系猪流感病毒核酸 RT-PCR鉴别诊断技术规范 Diagnostic Techniques procedures of RT-PCR assay for differenting subtypes of H1N1 Swine Influenza Virus nucleic acid 2015-04-30 发布 2015-06-30 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 24722015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预
2、防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：兰德松、顾贵波、赵凤菊、魏澍、李晓楠、孙世宇、杨作丰、李清竹、李红魁、申贯男、王海丰 DB21/T 24722015 II 引 言 猪流感（SI）是由A型猪流感病毒（SIV）感染猪引起的一种严重的呼吸道及免疫抑制传染病，已在世界大部分国家广泛存在并造成严重经济损失，是目前危害养猪业的重大疾病之一。同时猪被认为是流感病毒重组的“混合器”，SIV对流感病毒的流行、遗传衍化、跨物种传播以及在公共卫生学上都具有重要意义。从国内和我省近年来猪群中的检测结果来看，猪群主要以H1
3、N1亚型SIV流行为主并危害严重。H1N1亚型SIV主要以经典型、类禽型和甲型H1N1三个谱系感染最为普遍，危害最大。针对H1N1三个不同谱系的SIV，国内尚无RT-PCR检测方法方面的技术规范，应用本技术规范可在实验室对经典型、类禽型和甲型H1N1三个不同谱系的SIV做出快速、准确诊断，进而有针对性地采取综合防控措施。因此，本规范对于猪流感的检测和控制具有重要的意义，同时也为人、猪、禽流感防控提供预警信息奠定重要基础。DB21/T 24722015 1 H1N1 亚型不同谱系猪流感病毒核酸 RT-PCR 鉴别诊断技术规范 1 范围 本标准规定了H1N1亚型不同谱系（甲型H1N1、经典H1N1
4、及类禽型H1N1）猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）RT-PCR检测方法。本标准适用于甲型H1N1、经典H1N1及类禽型H1N1亚型猪流感的鉴别诊断和监测，适用于猪鼻咽拭子、脏器、鸡胚尿囊液及细胞培养物中H1N1亚型SIV核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全级（BSL-2）以上的实验室进行。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。SIV：猪流感病毒（Swi
5、ne influenza virus）DEPC：焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）bp:碱基对（Base pair）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）MLV:莫洛尼鼠白血病病毒（Murine leukemia virus）DTT：二硫苏糖醇（DL-Dithioth
6、reitol）PBS:磷酸缓冲液（Phosphate buffer soulution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer）4 原理 SIV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5 仪器和器材 DB21/T 24722015 2 高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000 g以上）。冰箱（28，-20 和-70）。PCR扩增仪。电泳仪。凝胶成像系统。微波
7、炉。微量移液器。6 试剂和材料 6.1 Trizol：RNA 提取抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于 48 保存。6.2 氯仿：4 预冷。6.3 异丙醇：4 预冷。6.4 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC 水配制，-20 预冷。6.5 DEPC 水：去离子水中加入 0.1%DEPC，37 作用 1 h；（121 士 2），高压灭菌 15 min。6.6 RNA 酶抑制剂（40 U/L）。6.7 DNA 聚合酶：HS Taq DNA 聚合酶（5 U/L）。6.8 dNTP(2.5 mmol/L)。6.9 用于 RT-PCR 反应的引物浓度为 20mol/L，其序列如下：经典型上
8、游引物F:GGACATGTTACCCAGGAGA 经典型下游引物R:ACTGGTAGGTGGATGGTGAA 类禽型上游引物F:TGGAGCATGCTACCCCGGAGA 类禽型下游引物R:CCATACATCCAAAAACCCATC 甲型上游引物F:TATTCCCCAAGACAAGTTCA 甲型下游引物R:ATCGTGGACTGGTGTATCTG 6.10 反转录酶：M-MLV 反转录酶（5 U/L）。6.11 DTT(0.1 mmol/L)。6.12 反转录引物 Uni 12：AGCAAAAGCAGG（20 mol/L）。6.13 阴性对照：DEPC 水。6.14 阳性对照：不同谱系 SIV
9、 阳性质粒。6.15 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L pH7.2）。6.16 TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液。6.17 溴化乙锭。6.18 DL2000 DNA Marker。注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。7 操作步骤 7.1 样品的采集、前处理、存放和运送 7.1.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，防止样本交叉污染。DB21/T 24722015 3 7.1.2 采样工具 病毒采集管；经121（士2）高压灭菌15 min的15 mL离心管和1.5 mL离心管；经160 干热灭菌2 h的剪刀、镊子。7.1.3
10、猪鼻腔、咽喉拭子的采集与前处理 用病毒采集管采取临床疑似活体猪的鼻腔、咽喉拭子，编号备用，待检。7.1.4 猪脏器的采集与前处理 7.1.5 称取 1 克病死猪的肺脏，进行研磨，然后加入 1 mL 灭菌 PBS，混匀，3000 r/min 离心 20 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中编号备用。7.1.6 鸡胚尿囊液 将无菌收集盲传三代的鸡胚尿囊液转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.7 细胞培养液 细胞培养物冻融3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.8 存放与运送 采集或处理的样品在28 条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置温度低于-70 冰箱，但应避免反
11、复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在68 h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7.2 RT-PCR 检测 7.2.1 RNA 提取 7.2.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为待检样品数+阳性管数+阴性管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2 每管加人 750 L Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各 250 L，颠倒 10 次混匀，室温静置 5 min；再加入 250 L 氯仿，混匀器上振荡混匀 15 s(也可以用手反复颠倒混匀)。4 12000 g 离心 15 min。7.2.1.3 取
12、与 7.2.1.1 中相同数量灭菌的 1.5 mL 离心管，加入 500 L 异丙醇(4预冷)。取 7.2.1.2中离心后的上清液约 500 L 转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置 15 min。7.2.1.4 4 12000 g 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 1 mL 75%DEPC 乙醇，洗涤。7.2.1.5 4 12000 g 离心 10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗涤 2 次。7.2.1.6 4000 g 离心 10 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥 310 min。7.2.1.7 加入 20 L 经 DEPC 处理的水，
13、轻柔混匀，溶解管壁上的 RNA，冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增；若需长期保存应放置-70 冰箱。7.2.2 反转录 7.2.2.1 反转录体系 建立25 L的反应体系，按下列组分加入离心管中：DB21/T 24722015 4 DEPC水 8.5 L dNTP（2.5 mmol/L）2 L Uni12 引物(20 mol/L)1 L DTT(0.1 mmol/L)2.5 L 5Reverse Transcriptase XL Buffer(5倍缓冲液)5 L M-MLV反转录酶 0.5 L RNA酶抑制剂 0.5 L 实验样品RNA 5 L 7.2.2.
14、2 反转录条件 混匀后在37 水浴锅中反应1 h；在70 水浴锅中反应15 min；反转录产物直接用于PCR或-20 保存备用。7.2.3 PCR 7.2.3.1 PCR 反应体系 建立25 L的反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：Premix EX Taq 12.5 L 反转录产物（cDNA）1 L 上游特异性PCR引物(20 mol/L)0.5 L 下游特异性PCR引物(20 mol/L)0.5 L 灭菌蒸馏水 10.5 L 7.2.3.2 PCR 反应反应条件 94 预变性3 min；94 变性30 s，54 退火30 s，72 延伸1 min，35个循环；72 终延伸7 min
15、。7.2.3.3 电泳 取PCR扩增产物6 L点样于1%琼脂糖凝胶（见附录A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DNA 2000 Marker（分子质量标准物质）6 L，缓冲液为1TAE，以5 V/cm电压电泳20 min，将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。8 试验成立的条件 当甲型H1N1 SIV 阳性对照出现在476 bp扩增条带、阴性对照未出现目的条带；经典H1N1 SIV 阳性对照出现在293 bp扩增条带、阴性对照未出现目的条带；类禽型H1N1 SIV 阳性对照出现在997 bp扩增条带、阴性对照未出现目的条带时，表明试验有效，否则试验无效。9 结果判定 9.1 阳性判定
16、 应用甲型H1N、经典H1N1和类禽型H1N1三种谱系H1N1 SIV的检测引物，按照各基因检测体系对样品进行检测，被检样品出现476 bp扩增条带则判定为甲型H1N1 SIV核酸阳性；出现293 bp扩增条带则判定为经典H1N1 SIV核酸阳性；出现997 bp扩增条带则判定为类禽型H1N1 SIV核酸阳性。DB21/T 24722015 5 9.2 阴性判定 如果在所用不同谱系检测引物预期扩增片段的位置未出现目的条带，则判定为相应谱系H1N1 SIV核酸阴性。DB21/T 24722015 6 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 0.02 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 A.1.1 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H20)71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO42H20)31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000 mL，混匀。A.1.3 量取0.2 moL/L磷酸氢二钠溶液360 mL，0.2mo
