1、 ICS 65.020.30 B 41 备案号：35742-2013 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 16082012 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光 RT-PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Bovine viral diarrhea/mucosal disease 2012-12-01 发布 2013-01-01 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内
2、部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16082012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局技术中心。本标准主要起草人：孟庆峰、王伟利、吴连鹏、王玮琳、肖成蕊、蔡阳、宋战昀、孟日增。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16082012 1 牛病毒
3、性腹泻/粘膜病病毒荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVDV）荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（Cycle Threshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（D
4、iethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（Taq DNA polymerase）RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（Real Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）4 原理 采用TaqMan方法，比对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5端非编码区最保守的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光
5、基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1 试剂 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准
6、仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16082012 2 5.1.1 水：配制方法见附录 A.1。5.1.2 Catrimox-1 4(Cat-14)。5.1.3 酚。5.1.4 三氯甲烷。5.1.5 柠檬酸钠。5.1.6 正丁醇。5.1.7 乙酸钠。5.1.8 乙醇。5.1.9 异丙醇（-20 预冷）。5.1.10 其他试剂：AMV 反转录酶(5 U/L)、Rnase Inhibitor(40 U/L)、10AMV RT PCR buffer、MgCL2(25 mM)、dNTP Mixture(各 10 mM)、EX-Taq酶(5 U/L)。5.1.11 引物：根
7、据病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）国际标准株基因序列设计合成一对特异性引物：上游引物 5-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3，下游引物 5-AACCACTGACGACTAC CCTGTACT-3，TaqMan 探针（FAM）5-CCATCCAACGAACTCACCACTGTTGC-3（TAMRA）均配制成 20 umol/L，-20 保存。5.2 对照样品的制备 5.2.1 阳性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将牛病毒性腹泻粘膜病国际标准毒株按 10%接种原代牛睾丸细胞，于 37 吸附 1 h 后加入维持液（见附录 A.2），37 培养，待 CPE 达到 70%时收获病
8、毒悬液，冻融 2 次3 次，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。5.2.2 阴性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融 2 次-3 次，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。6 仪器 6.1 荧光 PCR 检测仪。6.2 高速台式冷冻离心机（最高可达 13 000 r/min）。6.3 微量移液器：0.5 L10 L，5 L20 L，20 L200 L，100 L1000 L。6.4 组织匀浆器。6.5 混匀器。6.6 二氧化碳培养箱。7 操作步骤 7.1 样本的处理 7.1.1 组织样品：包括肠粘膜刮取物、肾、肝、肺、淋
9、巴结、脾、胸腺。取 2 g5 g 组织样品切成小块，加 5 mL15 mL 预冷的 Hanks 平衡盐溶液匀浆 2 min，制成悬液，4 5 000 r/min 离心取 150 L上清液加入 1 mLCat-14 振荡混匀。7.1.2 液体样品：包括血清、血液（加柠檬酸盐、EDTA、肝素等）、各种拭子（鼻腔、气管和眼）、精液。7.1.2.1 含 EDTA 的血液：取 50 L 加装有 1 mL1SSC（见附录 A.3 章）溶液的离心管中，混匀，4 12 000 r/min，离心 1 min，倒掉上清液，将沉淀物重新悬浮于残留液中，加入 500 LCat-14 振荡混匀。本标准仅供内部使用 不得
10、翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16082012 3 7.1.2.2 含柠檬酸钠或肝素的血液：取 50 L 加入 500 L Cat-14 振荡混匀。7.1.2.3 血清、精液、各种拭子悬液等液体样品：取 100 L 加入 500 L Cat-14 振荡混匀。7.1.2.4 阴性和阳性对照样品：分别取 100 L 加入 500 L Cat-14 振荡混匀。7.2 样本 RNA 的提取 7.2.1 将 7.1 中各种处理物立即震荡 30 s，室温放置 10 min30 min,4 12 000 r/min，离心 5 min，倒
11、置于吸水纸上，吸去液体，瞬时离心 5 s，用带滤芯的吸头吸干残留液体，将沉淀溶于 200 L GITC（见附录 A.4）缓冲液里，间歇振荡 5 min，置于冰上。7.2.2 将 7.2.1 中悬浮物用 100 L 水饱和酚和 100 L 预冷的含 2%正丁醇的三氯甲烷进行抽提，振荡 30 s，4 12 000 r/min，离心 5 min；取上清液加入 100 L 预冷（-20）的含 2%正丁醇的三氯甲烷振荡 30 s，4 12 000 r/min，离心 5 min，取上清液。7.2.3 上清液加入 300 L 异丙醇，-70 冻存 0.5 h，或者-20 至少 1 h。7.2.4 取出后 4
12、 12 000 r/min，离心 5 min，用 500 L80%乙醇漂洗，再用 500 L100%预冷（-20）的乙醇漂洗。干燥后加入 50 LDEPC 水，溶解 RNA，轻轻混匀，2 000 r/min 离心 5 s。冰上保存备用，若放置-70 可长期保存。7.3 荧光 RT-PCR 反应 7.3.1 反应体系 用漩涡混匀器将表1中各组分混匀后瞬间离心，备用。表1 荧光 PCR 反应体系 成分 用量（L）10AMV RT PCR buffer 2.5 MgCL2(25 mM)5.0 Dntp Mixture(各 10 mM)2.5 Rnase Inhibitor(40 U/L)0.5 AM
13、V 反转录酶(5 U/L)0.5 EX-Taq酶(5 U/L)0.5 上游引物(20 mol/L)0.5 下游引物(20 mol/L)0.5 探针(20 mol/L)0.5 待检 RNA 模板 5.0 Rnase Free dH2O 7.0 总计 25.0 7.3.2 反应参数 将7.3.1中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下：第一阶段，反转录 42 30 min；第二阶段，预变性 92 3 min；第三阶段，92 10 s、45 30 s、72 1 min，5 个循环；第四阶段，92 10 s、60 33 s，35 个循环，荧光收集设置在第四阶段
14、每次循环的退火延伸时进行。8 结果判定 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16082012 4 8.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。8.2.2 阳性对照的 Ct 值应28，并出现特定的扩增曲线。8.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。8.3 结果描述及判定 8.3.1 阴性判定 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中
15、无牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸。8.3.2 阳性判定 Ct值30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16082012 5 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 DEPC处理的双蒸水及离心管、吸头处理方法 1 000mL 双蒸馏水加 1 mLDEPC，室温放置 24 h 以上，0.105 Mpa 蒸汽高压 30 min。4 或室温保存。离心管、吸头应放在0.1%DEPC水中浸泡24 h以上，取出烘干DEPC水后再121高压灭菌30 min，晾干后使用。A.2 维持液 DMEM培养基内含青霉素200 IU/mL，链霉素200 IU/mL，抽滤除菌。A.3 1SSC溶液 0.15 mol/L氯化钠（NaCl）、15 mmol/L柠檬酸钠、pH7。A.4 GITC缓冲液 4 mol/L异硫氰酸胍、0.2 mol/L乙酸钠（pH4）、0.1 mol/L2-巯基乙醇。B _ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印
