1、 DB53/T 4912013 暗褐网柄牛肝菌菌种 2013-08-01 发布 2013-10-01 实施云南省质量技术监督局 发 布 ICS 67.080.20 B 31 中华人民共和国国家质量监督 检验检疫总局备案号：38302-2013 DB53/T 4912013 I 前 言 本标准按照GB/T1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由云南省农垦总局提出并归口。本标准起草单位：云南省热带作物科学研究所。本标准主要起草人：张春霞、何明霞、刘静、王文兵、伍英、高锋、纪开萍、曹旸、王云。DB53/T 4912013 1 暗褐网柄牛肝菌菌种 1 范围 本标
2、准规定了暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus（Berk.&Broome）Boedijn）菌种的术语和定义、质量要求、试验方法、检验规则及标签、标志、包装、运输、贮存等。本标准适用于暗褐网柄牛肝菌菌种。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 191 包装储运图示标志 GB/T 4789.282003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB 9688 食品包装用聚丙烯成型品卫生标准 GB/T 127282006 食用菌术
3、语 GB 191722003 平菇菌种 NY/T 5282010 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728、GB 19172及NY/T 528界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了GB/T 12728、GB 19172及NY/T 528的某些术语和定义。3.1 母种 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物。也称一级种、试管种。NY/T 5282010,定义3.4 3.2 原种 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。也称二级种。NY/T 5282010，定义3.5 3.3 栽培种 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。
4、栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种。也称三级种。NY/T 5282010,定义3.6 3.4 菌核 DB53/T 4912013 2 由营养菌丝集结成的坚硬的能抵抗不良环境的休眠体。如茯苓、猪苓等菌丝体在地下所形成的块状物。GB/T 127282006,定义2.2.32 3.5 颉颃现象 具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线行边缘的现象。GB 191722003,定义3.4 3.6 角变 因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。GB 191722003,定义3.5 3.7 高温抑制线 食用菌菌种在生产过程中受高温的不良影响，培
5、养物出现的圈状发黄、发暗或菌丝变稀弱的现象。GB 191722003,定义3.6 3.8 生物学效率 单位质量培养料的风干物质所培养产生出的子实体或菌丝体质量（鲜重），常用百分数表示。如风干料100 kg产生了新鲜子实体50 kg，即为生物学效率50%。GB/T 127282006,定义2.1.27 3.9 种性 食用菌的品种特性，是鉴别食用菌菌种或品种优劣的重要标准之一。一般包括对温度、湿度、酸碱度、光线和氧气的要求，抗逆性、丰产性、出菇迟早、出菇潮数、栽培周期、商品质量及栽培习性等农艺性状。NY/T 5282010,定义3.9 3.10 杂菌 食（药）用菌培养中引起污染的微生物。GB/T
6、12728-2006,定义 2.7.1 3.11 ITS 序列 在真菌鉴定中，18S与28S基因之间的序列称为ITS序列，由18S与5.8S基因之间的内转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、5.8S 与28S基因之间的内转录间隔区2（ITS2）三部分组成。4 质量要求 4.1 母种 4.1.1 容器规格 使用玻璃试管或培养皿。试管的规格 18 mm180 mm 或 20 mm200 mm。棉塞要使用梳棉或化纤棉，不应使用脱脂棉；也可用硅胶塞代替棉塞。DB53/T 4912013 3 4.1.2 感官要求 应符合表 1 规定。表1 母种感官要求 项目 要求 容器 完整，无损 棉塞或硅胶塞 干燥
7、、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求 培养基灌入量 为试管总容积的 1/41/5 斜面长度 顶端距棉塞或硅胶塞 40 mm50 mm 接种块大小（接种量）（3 mm5 mm）（3 mm5 mm）菌丝生长量 长满斜面 菌丝体特征 黄褐色、浓密、粗壮，菌种表面允许有少量菌核 菌丝体表面 均匀、平整、无角变 菌丝分泌物 暗褐色分泌物 菌落边缘 整齐 菌种外观 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，其中含有菌丝体分泌的暗褐色色素。气味 有暗褐网柄牛肝菌菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味。4.1.3 微生物要求 应符合表2规定。表2 母种微生物要求 项目 要求 菌丝形态 显微镜下观察菌丝无色透明，
8、有锁状联合，边缘光滑整齐，多分支，直径约 3 m。杂菌 无 4.1.4 菌丝生长速度 在适宜培养基上，在黑暗、适温（291）下，菌丝（1520）d长满斜面。4.1.5 母种栽培性状 供种单位所供母种需经出菇试验确认农艺性状和商品性状等种性合格后，方可用于扩大繁殖或出售。产量性状在正常条件下生物学效率应不低于25%。4.1.6 菌丝可溶性蛋白电泳图谱特征 电泳图谱在Rf=0.34，0.45，0.48（Rf为电泳条带的相对迁移率）处具染色很深的蛋白带。4.1.7 ITS 序列特征 供试菌株的ITS序列与暗褐网柄牛肝菌H-01-3-1的ITS序列（GeneBank登录号为GQ253574）进行比对，
9、相似性应达98%以上。4.2 原种 DB53/T 4912013 4 4.2.1 容器规格 使用850 mL以下、可耐受126 的、无色或近无色的、瓶口直径4 cm的玻璃瓶或近透明的耐高温塑料瓶，或（1528）cm、可耐受126 的、符合GB 9688规定的聚丙烯塑料袋。各类容器都应使用棉塞，棉塞应符合4.1.1规定；也可用能满足滤菌和透气要求的无棉塑料盖代替棉塞。4.2.2 感官要求 应符合表 3 规定。表3 原种感官要求 项目 要求 容器 完整，无损 棉塞或无棉塑料盖 干净、洁净、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离 50 mm5 mm 接种量（每支母种接原种数，
10、接种物大小）（68）瓶（袋），（1215）mm 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 黄褐色，浓密，粗壮，菌种表面允许有少量菌核 培养物表面菌丝体 生长均匀，无角变，无高温抑制线 培养基及菌丝体 无干缩，紧贴瓶（袋）壁 培养物表面分泌物 暗褐色分泌物 杂菌菌落 无 颉颃现象 无 菌种外观 子实体原基 无 气味 有暗褐网柄牛肝菌菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味。4.2.3 微生物要求 应符合表2规定。4.2.4 菌丝生长速度 在适宜培养基上，在适温（291）下，（4555）d菌丝长满容器。4.3 栽培种 4.3.1 容器规格 使用符合 4.2.1 规定的容器，也可使用（1735）cm、可耐受 12
11、6、符合 GB 9688 规定的聚丙烯塑料袋。各类容器都应使用棉塞或无棉塑料盖，并符合 4.2.1 规定。使用耐126 高温的具孔径0.2 m0.5 m无菌透气膜的聚丙烯塑料袋，规格为630 mm360 mm80 m，无菌透气膜2 个，规格为35 mm35 mm，或495 mm320 mm60 m，无菌透气膜1 个，规格为35 mm35 mm。4.3.2 感官要求 应符合表 4 规定。DB53/T 4912013 5 表4 栽培种感官要求 项目 要求 容器 完整、无损 棉塞或无棉塑料盖 干净、洁净、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离 50 mm5 mm 接种量每瓶（
12、袋）原种接栽培种数 30 瓶（袋）50 瓶（袋）菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 黄褐色，浓密，粗壮，菌种表面允许有少量菌核 不同部位菌丝体 生长均匀，色泽一致，无角变，无高温抑制线 培养基及菌丝体 无干缩，紧贴瓶（袋）壁 培养物表面分泌物 暗褐色分泌物 杂菌菌落 无 颉颃现象 无 菌种外观 子实体原基 无 气味 有暗褐网柄牛肝菌菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味。4.3.3 微生物学要求 应符合表 2 规定。4.3.4 菌丝生长速度 在适宜培养基上，在适温（291）下，（5060）d 菌丝长满容器。5 试验方法 5.1 感官检测 按表5进行检测。表5 感官要求检测方法 检测项目 检测方法 容
13、器 肉眼观察、直尺测量 棉塞、无棉塑料盖 肉眼观察 母种培养基灌入量 肉眼观察 母种斜面长度 直尺测量 母种菌落边缘 肉眼观察 母种斜面背面外观 肉眼观察 母种、原种 肉眼观察、直尺测量 接种量 栽培种 检查生产记录 培养基上表面距瓶（袋）口的距离 直尺测量 菌丝生长量 肉眼观察 菌丝体特征 肉眼观察 DB53/T 4912013 6 表 5（续）检测项目 检测方法 培养基表面菌丝体 肉眼观察 培养基及菌丝体 肉眼观察 培养物表面分泌物 肉眼观察 杂菌菌落 肉眼观察，必要时用 5 倍放大镜观察 颉颃现象 肉眼观察 子实体原基 肉眼观察 气味 鼻嗅 5.2 微生物检测 5.2.1 菌丝形态检测
14、表 2 中菌丝形态用放大倍数不低于（1040）的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于 50 个视野。5.2.2 杂菌检测 5.2.2.1 细菌检测 培养基菌落均匀一致则无污染，如果菌落边缘等处出现明亮异样菌落即为疑似细菌菌落；若有疑似细菌菌落，取少量疑有细菌污染的培养物，按无菌操作接种于 GB/T 4789.282003 中 4.8 规定的营养肉汤培养液中，（2528）振荡培养（12）d，观察培养液是否混浊。培养液混浊，则为有细菌污染；培养液澄清，则为无细菌污染。5.2.2.2 霉菌检测 培养基菌落均匀一致则无污染，如果菌落边缘或其它处出现毛绒状等异样（形态、色泽）菌落即为
15、疑似霉菌菌落；若有疑似霉菌菌落，取少量疑有霉菌污染的培养物，按无菌操作接种于PDA培养基（配方见附录A）中，（2528）培养（34）d，出现非暗褐网柄牛肝菌菌丝形态菌落的，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行水封片镜检。5.3 菌丝生长速度检测 5.3.1 母种：M1 培养基或 PDA 培养基（见附录 A），（291）培养，记录长满斜面所需天数。5.3.2 原种和栽培种：按附录 B 的配方要求，在（291）培养，计算长满所需天数。5.4 菌丝可溶性蛋白电泳图谱特征检测 按照附录C进行操作。5.5 ITS 序列特征检测 按照附录D进行操作。5.6 母种栽培性状检测 将被检母种制成原种、栽培种。采用
16、附录B的配方，制作菌袋45 个。接种后分三组进行常规管理，按照附录E所列项目，做好栽培记录，统计检验结果。同时将该母种的出发菌株设为对照，亦做同样处DB53/T 4912013 7 理。对比二者的检验结果，以时间计的检验项目中，被检母种的任何一项时间较对照菌株推迟10 d以上（含10 d）者，为不合格；产量显著低于对照菌株者，为不合格；菇体外观形态与对照明显不同或畸形者，为不合格。6 检验规则 6.1 组批规则 同一来源、同一培养基配方的产品作为一个检验批次；同一天接种、同一培养条件和质量基本一致作为产品的一个检验批次。6.2 抽样 6.2.1 抽样数量 6.2.1.1 母种按培养条件、接种时间分批编号，原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。6.2.1.2 母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批菌种量的 10%、5%、1%。但每批抽样数量不得少于10 支（瓶、袋）；超过 100 支（瓶、袋）的，随机取样 100 支（瓶、袋）。6.2.2 抽样方法 在整批货物的按级别堆垛中，随机抽取所需样品。每次随机抽取样品平均分为两份，其中一份作为检样，另一份作为留样
