1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 29062022 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范 Technical specification for isolation and identification of swine gaeta virus 2022-05-20 发布 2022-07-01 实施 四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 29062022 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 试剂与设备.1 主要试剂.1 5.1 主要仪器设备.2 5.2 6 样品的采集、保存与运输.2
2、猪只临床发病特征.2 6.1 临床样品的采集.2 6.2 保存与运输.2 6.3 7 病毒的细胞分离培养.2 生物安全措施.2 7.1 样品的处理.2 7.2 单层细胞制备.2 7.3 接种细胞.2 7.4 病毒收获.3 7.5 8 病毒核酸 RT-PCR 鉴定.3 核酸提取和反转录.3 8.1 RT-PCR 扩增.3 8.2 9 结果判定.4 RT-PCR.4 9.1 病毒分离鉴定.4 9.2 附录 A（规范性）试剂配制.5 附录 B（资料性）猪源盖塔病毒 CAP 基因扩增序列.6 DB51/T 29062022 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化
3、文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。本文件主要起草人：陈斌、朱玲、钟攀、陈弟诗、周明忠、徐志文、邓飞、邵靓、李丽、周莉媛、张睿、谢嘉宾、王英、文豪、徐凯、黄先奇、陈亮、张国华、李莎莎、吉色曲伍、孙贤刚、江朝源。本文件首次发布。DB51/T 29062022 1 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了猪源盖塔病毒分离与鉴定方法。本文件适用于猪及其产品中盖塔病毒病原分离和鉴定、实验室诊断、监测和流行病学调查。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的
4、条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BHK-21：乳仓鼠肾源细胞 CPE：细胞病变 DMEM：细胞营养液 DNA marker：DNA相对分子质量标记 FBS：胎牛血清 GETV：盖塔病毒 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸 PBS：磷酸缓冲液 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反
5、应 5 试剂与设备 主要试剂 5.1 5.1.1 所用生化试剂均为分析纯。5.1.2 实验用水应符合 GB/T 6682 一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。5.1.3 BHK-21、DMEM 培养基、FBS、HEPES 缓冲液(1mol/L 储存液)、0.01 mol/L pH 7.07.4 PBS(参见附录 A)；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR 反应混合液（2）。DB51/T 29062022 2 主要仪器设备 5.2 微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。6 样品的采集、保存与运输 猪只临床发
6、病特征 6.1 新生仔猪出现腹泻、厌食、皮肤红变、舌颤、肢体不协调，10日龄以上小猪出现精神颓废、发热、食欲减退、日增重显著下降和妊娠母猪出现繁殖障碍综合征等临床症状时，均可认为疑似猪盖塔病毒感染。临床样品的采集 6.2 采取疑似猪盖塔病毒感染的淋巴结、胎盘、羊水、死胎、肺、肝、肾、小脑等靶组织约2g5g或血液样品1 mL2 mL，组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝血管中待检。保存与运输 6.3 采集的样品应按照 NY/T 541（所有部分）要求包装和运输，尽快运送到实验室。样品在2 8 条件下保存不超过24 h；若超过24 h，放置低于-20冰箱，不宜反复冻融。7 病毒的细胞分离培
7、养 生物安全措施 7.1 GETV分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB 19489（所有部分）的规定执行。样品的处理 7.2 7.2.1 组织样品 取0.5 g1 g待检组织样品，加入1mL1.5mL PBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，4 3000 r/min离心10 min，取上清液，以0.22m无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5 mL离心管中，-70 保存备用。7.2.2 血液样品 用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，3000 r/min离心10min，取上清液，以0.22 m无菌滤膜过滤除菌
8、后，转入1.5 mL离心管中，-70 保存备用。单层细胞制备 7.3 按常规法将BHK-21细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶分装含8%FBS的DMEM培养基5 mL，细胞浓度应为2 105个/mL3 105个/mL，培养48 h。接种细胞 7.4 DB51/T 29062022 3 取制备后的组织样品或血液样品上清液0.2mL接种到生长状况良好的单层BHK-21细胞上（5mL工作体积）。每份样品接种2瓶4瓶细胞，另设细胞对照2瓶4瓶。37 C吸附1 h，弃上清，加入2ml含2%FBS的DMEM培养基，37、5%CO2条件下培养48h。病毒收获 7.5 每天观察记录CPE，通常在接种12h
9、48 h内可出现CPE，感染BHK-21细胞后约12h，细胞出现空洞；24h后细胞明显变圆，部分开始脱落；36h后大量脱离，贴壁细胞大部分变圆。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三次，4 3000 r/min离心10min，收获病毒上清液，置-70 保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37 培养12h48h。盲传3代，再进行鉴定。8 病毒核酸 RT-PCR 鉴定 核酸提取和反转录 8.1 采用RNA提取试剂盒提取处
10、理后的临床样品或收集到的细胞/病毒液核酸，或用自动化核酸提取仪提取，并使用反转录试剂盒将提取核酸反转录成cDNA，于-20保存备用。RT-PCR 扩增 8.2 8.2.1 引物 引物针对GETV CAP基因保守区域。上游引物（10mol/L）：5-ACCGAAGAAGCCGAAGAA-3；下游引物（10mol/L）：5-GCACTCRAGGTCATACTTG-3，扩增产物大小为316 bp。8.2.2 反应体系 反应体系见表1，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。表1 RT-PCR 反应体系 PCR反应试剂 体积(L)2TaqPCRmaster Mix 5 上游引物（10 mol/L）0.5
11、 下游引物（10 mol/L）0.5 cDNA模板 1 ddH2O 3 8.2.3 反应程序 反应程序见表2。表2 RT-PCR 反应程序 步骤 时间和温度 循环数（个）预变性 5 min、95 1 变性 30 s、95 35 退火 30 s、56 延伸 30 s、72 延伸 7 min、72 1 DB51/T 29062022 4 8.2.4 琼脂糖凝胶电泳成像 取适量扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中观察结果。9 结果判定 RT-PCR 9.1 示例1：阳性对照出现大小为 316 bp 的特异性扩增条带，阴性对照无条带，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照大小一致的特异
12、性扩增条带，则判定为 GETV 核酸阳性；若样品电泳结果未出现特异性扩增条带，则判定为 GETV 核酸阴性。病毒分离鉴定 9.2 9.2.1 对核酸阳性扩增产物进行测序，其结果与附录 B.1 序列比对，进行确认。9.2.2 细胞发生 CPE、GETV RT-PCR 结果为阳性，且测序比对结果正确，则判定为 GETV 分离鉴定阳性。9.2.3 若盲传 3 代后，细胞并未发生 CPE，但核酸鉴定结果为阳性，则继续盲传至 5 代后，再进行核酸检测，若核酸鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为 GETV 分离阳性；若核酸鉴定结果为阴性，则判定为 GETV 分离鉴定阴性。9.2.4 若盲传 3
13、代后，细胞并未发生 CPE，核酸鉴定结果为阴性，则判定为 GETV 分离鉴定阴性。DB51/T 29062022 5 A A 附录A （规范性）试剂配制 A.1 0.01mol/L pH7.0-7.4 PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO412H2O 3.58g KH2PO4 0.27g 灭菌双蒸水 800mL NaOH或者HCl调pH值7.0至7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4备用。A.2 电泳缓冲液 TAE（50 倍）三羟甲基甲烷碱（Tris base）242g 冰乙酸 57.1mL 0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙
14、酸（EDTA）100mL 蒸馏水 100mL 待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。A.3 1.0%琼脂糖凝胶板制备 琼脂糖 1.0g 1 TAE缓冲液 100mL 0.5ug/mL溴化乙锭 5uL 微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。DB51/T 29062022 6 B B 附录B （资料性）猪源盖塔病毒 CAP 基因扩增序列 B.1 猪源盖塔
15、病毒 CAP 基因扩增序列 ACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAAGAAGAAGAAACCAGGAAAAAGGGAACGCATGTGCATGAAGATAGAGAATGATTGCATCTTCGAGGTCAAGCTTGACGGTAAGGTCACGGGATACGCCTGCCTAGTCGGGGATAAAGTGATGAAGCCGGCACACGTCAAAGGTGTGATCGACAACCCCGACCTAGCGAAGCTTACCTACAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGC
