1、ICS 11.220CCS B 41团体标准T/CVMA 892021规模化牛场牛结核病检测方法联用指南Application guideline of multiple tests for detection of bovinetuberculosis in large scale cattle farm2021-12-23 发布2021-12-23 实施中 国 兽 医 协 会发 布中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台I目次前言.1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 缩略语.25 平行检测.25.1 适用对象.25.2 单皮内变态
2、反应和 IFN-体外释放法联用.25.3 单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联用结果判定.26 系列检测.36.1 适用对象.36.2 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联用.36.3 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联用结果判定.36.4 单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联用.46.5 单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联用结果判定.47 临床剖检和/或细菌培养和 PCR 检测分型法联用.47.1 临床剖检.57.2 牛分枝杆菌分离培养.57.3 PCR 检测和分型法.58 生物安全操作要求.7附录 A（规范性）多重 PCR 检测牛结核分枝杆菌复合群的特异性引物序列.8中国兽医协会CV
3、MA全国团体标准信息平台T/CVMA 892021II前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件不涉及专利。本文件由华中农业大学提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：华中农业大学、湖北劲牛牧业有限公司、高安市裕丰农牧有限公司。本文件主要起草人：陈颖钰、郭爱珍、章恺伦、闫钰、李翔、陈焕春、曾稳兵、杨建军。中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 8920211规模化牛场牛结核病检测方法联用指南1范围本文件规定了规模化牛场牛结核病检测方法联用指南，包括牛结核病的平行检测、系列检测、临床剖检和/或细菌培养和PCR检测
4、分型法联用以及生物安全要求等。本文件适用于规模化牛场中牛结核病的检测、监测、控制及净化，以及实验室牛分枝杆菌的核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18088出入境动物检疫采样GB/T 18645动物结核病诊断技术GB 19489实验室 生物安全通用要求GB/T 27639结核病病原菌实时荧光PCR检测方法GB/T 32945牛结核病诊断 体外检测干扰素法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1平行检测par
5、alleltest也叫平行试验或并联试验，指同时利用两种或多种诊断试验进行检测，只要有任何一个试验结果为阳性就可定为阳性，只有全部试验结果均为阴性时才将结果判定为阴性。该方法可以提高灵敏度，降低特异度。3.2个体流行率individualprevalence特定时间内一定动物群体中患某病新旧病例数占同期观察动物数的比例。3.3系列检测seriestest中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 8920212又叫系列试验或串联试验，指依次利用两种或多种诊断试验进行检测，全部试验结果均为阳性，才将最终结果判断为阳性，任何一个试验结果为阴性就可定为最终结果阴性。该方法可以提高特异度，降
6、低灵敏度。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DMSO：二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide）ELISA：酶联免疫吸附测定（Enzymelinkedimmunosorbentassay）IFN-：伽马干扰素（Interferon-）PCR：多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction）5平行检测5.1适用对象当牛群结核病处于低流行率水平（如个体流行率3%；也可根据实际情况取更低或更高流行率水平）时，对该牛群进行平行检测。5.2单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联用按照GB/T18645中牛分枝杆菌PPD皮内变态反应的操作方法对牛进行单皮内变态反应（以下简称单皮试法）检
7、测，同时依据GB/T32945进行牛结核IFN-体外释放法检测，并联合判定最终检测结果。实际操作中，只对皮试法检测为阴性的个体，再使用IFN-体外释放法进行牛结核病的检测，并联合判定最终检测结果。5.3单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联用结果判定单皮试法与IFN-体外释放法两种方法中任何一种检测方法结果为阳性的个体，判为牛结核阳性个体，两种方法均为阴性的个体，才判断为阴性个体。单皮试法和IFN-体外释放法联用流程如图1所示。中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 8920213图 1牛结核病单皮内变态反应与 IFN-体外释放法联用流程图6系列检测6.1适用对象当牛群处于高流行
8、率水平（如个体流行率3%；也可根据实际情况取更低或更高流行率水平）时，对该牛群进行牛结核病系列检测。6.2单皮内变态反应和比较皮内变态反应联用当牛场不具备实验室检测操作条件时，按照GB/T18645进行单皮试法并判定结果。对检测阳性的个体，间隔42天后按照GB/T18645中比较皮内变态反应（以下简称比较皮试法）进行检测，并联合判断最终结果。6.3单皮内变态反应和比较皮内变态反应联用结果判定当比较皮试法为阳性结果时，该牛被判定为结核阳性牛。任何一种方法判断为阴性时则为阴性。单皮试法和比较皮试法联用流程如图2所示。中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 8920214图 2牛结核病
9、单皮内变态反应和比较皮内变态反应联用流程图6.4单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联用当牛场具备实验室检测操作条件时，先按照GB/T18645进行单皮试法并进行结果判定。对检测阳性的个体，间隔42天后依据GB/T32945进行IFN-体外释放法检测，并综合判定最终结果。6.5单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联用结果判定当IFN-体外释放法检测结果为阳性时，该牛被判定为牛结核阳性。两种方法任何一种判断为阴性时，则为阴性。单皮试法结合IFN-体外释放法联用流程如图3所示。图 3牛结核病单皮内变态反应结合 IFN-体外释放法联用流程图7临床剖检和/或细菌培养和 PCR 检测分型法联用中国兽医协
10、会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 89202157.1临床剖检对屠宰场宰杀牛或病死牛进行解剖，对牛的头、肺、肝、脾、肠、乳房、以及纵隔淋巴结、肝门淋巴结、肠系膜淋巴结、肺门淋巴结、乳房上淋巴结进行观察和触诊，检查是否存在疑似结核结节。对有结节处切开检查其是否存在化脓性病变和干酪样坏死病变。组织出现疑似结核结节时，则依照GB/T27639中采样方法采集病变组织，直接进行PCR检测和分型；或进行牛结核病细菌分离培养和PCR检测分型。7.2牛分枝杆菌分离培养按照GB/T18645中分枝杆菌分离培养和生化鉴定操作步骤进行。7.3PCR 检测和分型法7.3.1样本处理及核酸提取依照商品化核酸提
11、取试剂盒的使用说明进行样本的处理，并提取组织内核酸，直接用于PCR检测或储存于-80条件下备用。7.3.2PCR 模板PCR模板为7.3.1步骤中提取的待检测样品的核酸样本。同时取灭活的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌核酸为阳性对照。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。7.3.3PCR 引物针对结核分枝杆菌复合群16SrRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120等七个基因序列设计特异性引物并合成。引物序列见附录A结核分枝杆菌复合群特异性引物序列。7.3.4PCR 反应体系每个样品准备7个PCR反应管，依次标记为17号。将PCR预混液（2TaqMixt
12、ure）12.5L，模板1L，去离子水8L，DMSO1.5L，引物17的上下游引物（浓度为10m/L）各1L分别加入17号PCR反应管中，总体积为25L，充分混合。7.3.5PCR 反应程序将本文件7.3.4中7个PCR反应管放置于PCR仪中，设定反应程序。反应条件设定如下：第一阶段：9410min；第二阶段：94 1 min，60 1 min，72 1 min，30个循环；第三阶段：72 10min。7.3.6PCR 反应产物检测将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，120V，100mA条件下电泳30min。紫外灯下观察扩增产物，阳性对照的17号管PCR产物大小分别为543，786，943，1
13、033，1116，999和404bp，空白对照的17号管PCR产物均无条带时，反应成立。待检样本的1号PCR管出现阳性条带时，判定为分枝杆菌属感染，中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 8920216并依据表2进行结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及山羊分枝杆菌三个种的判定；若1号管为阴性，则不含有分枝杆菌属。7.3.7结果判定当样本为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或山羊分枝杆菌阳性时，该牛被判定为牛结核病阳性。PCR检测结果判定见表1。表 1PCR 检测结果判定PCR 结果记录结果记录PCR 产物引物 1引物 2引物 3引物 4引物 5引物 6引物 7+-分枝杆菌属+结核分枝杆菌+-+-牛分
14、枝杆菌+-+-山羊分枝杆菌+-牛分枝杆菌卡介苗-分枝杆菌属阴性7.3.8临床剖检和/或细菌培养诊断结合 PCR 检测分型法联用流程图临床剖检和/或细菌培养和诊断结合 PCR 检测分型法联用流程如图 4 所示。图 4牛结核病临床剖检和/或细菌培养和 PCR 检测分型法联用流程中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 89202178生物安全操作要求现场生物安全操作应符合GB/T18088、GBT18645-2020和GB19489的规定。实验室生物安全操作应符合GB19489的规定。中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台T/CVMA 8920218A A附录A（规范性）多重 PCR
15、 检测牛结核分枝杆菌复合群的特异性引物序列多重PCR检测牛结核分枝杆菌复合群的特异性引物序列见表A.1。表A.1 多重PCR检测牛结核分枝杆菌复合群的特异性引物序列引物名（基因名）核酸序列引物1（16SrRNA）上游引物5-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3下游引物5-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3引物2（Rv0577）上游引物5-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3下游引物5-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3引物3（IS1561）上游引物5-GCTGGGTGGGCCCTGGAATACGTGAACTCT
16、-3下游引物5-AACTGCTCACCCTGGCCACCACCATTGACT-3引物4（Rv1510）上游引物5-GTGCGCTCCACCCAAATAGTTGC-3下游引物5-TGTCGACCTGGGGCACAAATCAGTC-3引物5（Rv1970）上游引物5-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3下游引物5-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3引物6（Rv3877/8）上游引物5-CGACGGGTCTGACGGCCAAACTCATC-3；下游引物5-CTTGCTCGGTGGCCGGTTTTTCAGC-3引物7（Rv3120）上游引物5-GTCGGCGATAGACCATGAGTCCGTCTCCAT-3下游引物5-GCGAAAAGTGGGCGGATGCCAGAATAGT-3_中国兽医协会CVMA全国团体标准信息平台
