1、ICS 11.220B 41团体标准T/CVMA 932022猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法TRFIA for detection of antibodies Porcin Reproductive and RespriratorySyndrome Virus of American Type2022-08-12 发布2022-08-12 实施中国兽医协会发 布中国兽医协会 CVMAT/CVMA 932022I前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的
2、发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由洛阳现代生物技术研究院有限公司提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：洛阳现代生物技术研究院有限公司、中国科学院微生物研究所、河南省动物疫病预防控制中心、洛阳莱普生信息科技有限公司、湖州市动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：郎洪武、谢彩华、杨利敏、刘文军、程果、马震原、原小燕、耿玉静、刘影、李玉婉、王华俊、刘慧芳、郭育培、王翠。中国兽医协会 CVMAT/CVMA 9320221猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法1范围本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体荧光层析检测方法、试剂与耗材、技术原理、实验前准
3、备工作、操作步骤、结果计算、实验成立条件及结果判定等内容。本文件适用于检测猪全血或血清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体，并可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体的免疫筛查、辅助诊断等。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1时间分辨荧光免疫层析技术 Time Resolved Fluorescence Immunochroma
4、tography assay（TRFIA）是以时间分辨荧光微球作为示踪物，将抗原抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析来呈现免疫反应结果的一种新型免疫分析技术。4试剂与耗材4.1猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体荧光微球检测卡的制备，按照附录 A 制备。4.2相关试剂配制，按照附录 B 制备。4.3微量毛细采样管（10 L）。4.4移液枪（10 L100 L）。4.5便携式免疫荧光分析仪及配套 ID 卡，能在荧光检测波段 365/610 nm 条件下检测，按照附录 C 操作。4.6注射器（5 mL）。中国兽医协会 CVMAT/CVMA 93202225技术原理本检测试纸采用时间分辨荧光免疫层析方
5、法和间接法试验原理，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体。通过样本与荧光微球标记物沿层析膜移动，样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体（美洲型）与荧光微球标记物、检测线（T线）上的抗原结合而产生荧光信号值（T值），荧光微球标记物继续移动与质控线（C线）上的抗体结合产生荧光信号值（C值），仪器计算出T/C值即为PPRV抗体检测值。若样本中不存在猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体，则检测线不产生荧光信号。6实验前准备工作6.1样本采集及处理按照NY/T 541中规定进行样本的采集与处理，并做好个人防护。按常规方法抽取2 mL3 mL血液置洁净干燥的试管中，静置约1 h待血液凝固后于4000 r/m
6、in离心10 min（也可将血液样本静置约2 h，待血液凝固自然析出血清），分离血清。要求血清清亮，无溶血、无污染。若无上述条件分离血清，可直接用全血检测。全血样品容器中应加入下列抗凝剂中的任意一种：0.1%肝素钠、阿氏液、3.8%4.0%枸橼酸钠（0.1 mL可抗1 mL血液）、乙二胺四乙酸（EDTA）等抗凝剂，采血后充分混合。6.2血清样本的存放与运输按照NY/T 541中规定进行血清样本的存放与运输。血清样本若在一周内检测，可置2 8 条件下保存。若超过一周检测，应置于-20 以下冷冻保存。运输时注意冷藏，确保样品清亮无污染。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽
7、量缩短。按照相关规范进行样品的生物安全标识。6.3全血样本的存放与运输按照NY/T 541中规定进行全样本的存放与运输。全血样本若在24 h内检测，应置于4 条件下保存；若超过24 h检测，应置于-20 以下冷冻保存。采集的全血样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照相关规范进行样品的生物安全标识。7操作步骤7.1样品稀释将微量毛细采样管取10 L全血或血清样本加入到已备好的样本稀释液中混匀，稀释后的样品应在1 h内完成检测。可按照以下两种方式稀释：a)离心管稀释，将检测样本在 1.5 mL 离心管中做 10 倍稀释并混匀。b）稀释板稀释，将检测样本在稀释板上做 10
8、倍稀释并混匀。7.2取检测卡将恢复至室温的试纸卡从铝箔包装中取出，将检测卡放于平整、洁净的台面上。中国兽医协会 CVMAT/CVMA 93202237.3加样及孵育用配套吸管吸取待检样本，垂直而缓慢地滴加2 3 滴（约80 L）到加样孔内，室温下放置10min15 min。7.4仪器检测值读数前先将产品配套ID卡插入便携式荧光免疫分析仪，之后将反应到时间的检测试纸加样孔朝里插入便携式荧光免疫分析仪，点击“快速检测”进行读数，超过25 min的结果无效。8结果计算便携式荧光免疫分析仪通过365/610 nm光波激发和收集检测线（T线）和质控线（C线）上的荧光信号，仪器将荧光信号值转换成数值（T值
9、和C值），T/C值即为样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体检测值（软件自带计算功能，能准确计算出T/C值）。9实验成立条件当仪器完成读值后，如果“检测值”项显示“无效”，说明仪器未检测到荧光信号，则实验不成立，需重新检测。如果“检测值”项显示数值，说明质控线和检测线荧光信号值正常，则实验成立。10结果判定标准当PRRS检测值0.1时，为猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体阴性。当PRRS检测值0.1时，为猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体阳性。中国兽医协会 CVMAT/CVMA 9320224附录A（规范性）猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）抗体荧光微球检测卡的制备A.1重组猪繁殖与呼吸
10、综合征病毒（美洲型）NSP7 蛋白的制备A.1.1菌液繁殖用接种环挑取-70 保存的基础种子批（P5）E.coli-NSP7菌株划线于含30 g/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基，37 2 温箱倒置培养12 h16 h。挑取单菌落接种于少量LB液体培养基（含30 g/mL卡那霉素），在37 2 条件下、以200 r/min振荡培养8 h12 h。A.1.2重组NSP7蛋白的诱导表达将菌液以1%的接种量转接至LB液体培养基（含30 g/mL卡那霉素），在37 2 条件下，以200 r/min振荡培养至OD600 nm值达到0.6时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，在37 2 条件下，
11、以200 r/min继续振荡培养4 h。A.1.3重组NSP7蛋白的提取收集上述诱导表达菌液，在4 条件下、以5000 r/min离心10 min，弃上清，菌体用结合缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L咪唑，0.5 mol/L氯化钠）重悬混匀。重悬后的菌液于冰浴中进行超声裂解（设置功率为300 W、工作时间3 s、间歇时间4 s、总时间30 min）。取上述裂解完成的菌液，在4 条件下，以5000 r/min离心10 min，上清液即为纯化前的重组NSP7蛋白。A.1.4重组NSP7蛋白的纯化取超声裂解后的上清液，经0.22 m滤膜过滤，采用AKTA蛋白纯化系统纯化NS
12、P7蛋白，纯化后的产物即为生产用重组蛋白，无菌定量分装，-70 以下保存。A.2荧光微球垫的制备A.2.1荧光微球标记羊抗猪IgG的制备A.2.1.1洗涤按需量取固体含量为1%的荧光微球洗涤液，加入5倍体积的硼酸盐缓冲液（0.05 moL/L，pH值8.0），以12000 r/min离心15 min，弃上清，重复清洗2次，将洗涤后的荧光微球重悬于5倍体积硼酸盐缓冲液。A.2.1.2荧光微球活化取50 L荧光微球加之1 mLMES（2-吗啉乙磺酸）缓冲液中，混匀，12000 r/min离心15 min；弃上清，加入1 mLMES缓冲液，混匀离心；重复上述步骤3次，并用1 mLMES缓冲液复溶；向
13、上述溶液中加入250 LEDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）缓冲液，混匀，室温反应30 min；弃上清，加入4mL标记缓冲液，混匀。A.2.1.3荧光微球标记中国兽医协会 CVMAT/CVMA 9320225将羊抗猪IgG加入到已活化的荧光微球中，使其终浓度为50 g/mL，充分混匀，于室温（15 25）避光反应1.5 h；按溶液总体积的3%加入封闭液，混匀，于室温（15 25）避光反应30 min。离心弃上清，按A.2.1.1用硼酸盐缓冲液清洗2次，并重悬已标记的荧光微球。以1%的量加入1%胭脂红色素，混匀，2 8 保存备用。A.2.2荧光微球垫的制备待荧光微球标记羊抗猪Ig
14、G恢复至室温（15 25），取玻璃纤维素膜裁切成10 cm30 cm规格，设置喷涂量为3 L/cm，每张玻璃纤维素膜（10 cm30 cm）以1.0 cm间隔喷涂8条，将完成喷涂的玻璃纤维素膜放置在干净纱窗网上，置37（2）干燥2 h3 h，用切条机将喷涂有荧光微球标记羊抗猪IgG的部分裁切为0.7 cm30 cm的条带，于4 30 密封保存备用。A.3印膜的制备A.3.1印膜溶液的制备A.3.1.1质控线（C线）印膜溶液用磷酸缓冲液（0.05 mmol/L，pH值8.0）将兔抗羊IgG稀释至终浓度为1.5 mg/mL作为质控线（C线）印膜溶液，置于棕色玻璃瓶中，2 8 保存备用。A.3.1.
15、2 检测线印膜溶液用磷酸缓冲液（0.05 mmol/L，pH值8.0）将重组NSP7蛋白稀释至终浓度为1.2 mg/mL作为检测线印膜溶液，置于棕色玻璃瓶中，2 8 保存备用。A.3.2印膜将印膜溶液分别吸至高效连续点膜机的质控线管线和检测线管线中，按0.8 L/cm在硝酸纤维素膜上均匀划出质控线（C线）和检测线（T线），其中质控线（C线）距硝酸纤维素膜顶端0.8 cm（0.1 cm）处，检测线距膜顶端1.3 cm（0.1 cm）处，质控线与检测线相距0.5 cm（0.1 cm），并在膜的开始端、末端及不均匀处作标记。A.3.3印膜干燥将已划线的硝酸纤维素膜逐一放置在干净纱窗网上，忌重叠，置于
16、干燥间进行干燥，37 （2）干燥2 h后，将其放入装有干燥剂的铝箔袋内，封口，贴上标签，于4 30 密封保存备用。A.4样品垫的制备将20 cm30 cm的玻璃纤维素膜平铺于洁净的玻璃平板上，倾倒20 mL样品垫处理液至玻璃纤维素膜中央，滚轮铺匀，37（2）过夜干燥，用切条机将其裁切为2.0 cm30 cm，于4 30 密封保存备用。A.5检测卡的制备A.5.1制备环境在室温（15 25）及湿度30%RH的洁净环境下，按照以下步骤组装半成品试纸。中国兽医协会 CVMAT/CVMA 9320226A.5.2贴条依次按印膜、吸水垫、荧光微球垫、样品垫的顺序将各中间制品粘贴于PVC底板上，保证各中间品在相邻处均有1 mm2 mm层叠，并使印膜上的检测线靠近样品垫一侧、质控线靠近吸水垫一侧。A.5.3切条在室温（15 25）及湿度30%RH条件下，将已组装好的荧光微球大板修剪整齐后，用切条机将检验合格的半成品裁切为3.0 mm（0.1 mm）宽的试纸。A.5.4装卡挑取印膜无划痕、无污染，边缘整齐的试纸，将试纸装入卡壳中，使用压卡机进行压卡，单卡与干燥剂、滴管装入铝箔袋并封口。中国兽医协会 C
