1、ICS：71.100.70Y40团体标准团体标准T/HPCIA 007-2021化妆品 抗过敏的测定 斑马鱼胚法Cosmetics-Determination of anti-allergy-Zebrafish(Danio rerio)embryo assay2021 年 05 月 07 日发布2021 年 05 月 07 日实施广州开发区黄埔化妆品产业协会广州开发区黄埔化妆品产业协会发布全国团体标准信息平台目次前言.31.范围.42.术语和定义.43.规范性引用文件.44.方法原理.45.生物模型.46.材料试剂.47.仪器设备.58.实验过程.69.结果计算.610.质量控制.711.废弃
2、物处置.7附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图.8附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图.9附录 C（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法.10附录 D（资料性附录）数据记录表.11附录 E（资料性附录）斑马鱼养鱼及维护.12全国团体标准信息平台前言本标准是GB/T 1.1-2020给出规则起草。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会提出。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会归口。本标准起草单位：广东丸美生物科技股份有限公司、广州环亚化妆品科技有限公司、广东科玮生物技术股份有限公司、广州睿森生物科技有限公司、广州栋方生物科技股份有限公司、广州市科能化妆品科研有限公司、广东芭薇生物科技股份有
3、限公司、广东袋鼠妈妈生物科技有限公司、广州市暨优生物科技有限公司、广州奥蓓斯化妆品有限公司、广州鲁比生物科技有限公司、广州度普化妆品科学研究院、广州市络捷生物科技有限公司、广东省保化检测中心有限公司、广东药科大学、广东省人民医院、暨南大学化妆品与美容科学研究院。本标准主要起草人：郑伟东、梅文杰、孙云起、陈亮、刘芳、郑涌璇、谢水林、谢另球、邓慧、石品靖、孙永、何斌、王芬、黄晓婷、刘宁芝、袁婵龄、邹俊、黄裕、陈小佳。全国团体标准信息平台化妆品 抗过敏的测定 斑马鱼胚法化妆品 抗过敏的测定 斑马鱼胚法1.范围本标准规定了评价化妆品抗过敏的斑马鱼胚实验的方法原理及操作。本标准适用于化妆品（膏霜、乳液、
4、凝胶、精华，等）及化妆品原料的抗过敏测定评价。2.术语和定义2.1.hpf受精后小时数，即“hours post-fertilization”。2.2.Tryptase 表达水平（%）经致敏剂刺激后，斑马鱼胚胎中类胰蛋白酶的表达水平。2.3.Tryptase 抑制率（%）样品抑制类胰蛋白酶能力的强弱。3.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。化妆品安全技术规范（2015 版）QB/T 1684-2015 化妆品检验规则DB32T 3979-2021 实验用 斑马
5、鱼 饲育技术条件OECD 236 Fish Embryo Acute Toxicity(FET)Test4.方法原理使用 96 孔细胞培养板，在空白对照或溶剂对照控制的条件下，将 72 hpf 的斑马鱼胚胎置于受试样品预处理 2 h 后，加入 Compoud 48/80 诱导过敏反应，随后每孔加入 BAPNA 溶液于 37恒温培养箱中孵育 24 h 后，于酶标仪下测试各吸光度值，计算受试样品的 Tryptase 表达水平和抑制率。5.生物模型5.1 成鱼采用性成熟、健康无畸形、产卵量高、产卵质量好的野生型斑马鱼 zebra fish（Danio rerio）成鱼（418 个月）进行产卵。成鱼的
6、体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。5.2 鱼胚实验鱼胚为处于 72 hpf 时期发育正常的斑马鱼胚胎，实物鉴别参考附录 A。5.3 鱼的养殖维护斑马鱼养殖及维护参考附录 E。6.材料试剂6.1.材料全国团体标准信息平台6.1.1 斑马鱼交配盒：参考附录 B。6.1.2 胚胎收集器：100.0 mm 培养皿，参考附录 B。6.1.3 细胞培养板：96 孔细胞培养板：每孔容积 200.0 l。6.1.4 离心管：10.0、15.0、50.0 ml。6.1.5 塑料滴管：3.0 ml，长约 150.0 mm。6.2 试剂除非另有说明，
7、分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用蒸馏水或去离子水。6.2.1 二甲基亚砜。6.2.2 N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物(Compoud 48/80)。6.2.3 浓盐酸。6.2.4 三羟甲基氨基甲烷。6.2.5N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)。6.2.6氯化钠（NaCl）。6.2.7氯化钾（KCl）。6.2.8氯化钙(CaCl22H2O)。6.2.9硫酸镁(MgSO47H2O)。6.2.10 标准稀释水。6.3 对照品6.3.1 色甘酸钠标准品，纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物6.4 溶液配制6.4.1 盐酸溶液（0.1
8、mol/L）：精密量取浓盐酸 23.0 ml，用标准稀释水溶解并定容至 250 ml，于 28保存。6.4.2 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(Tris-HCl 溶液)(1.0 mol/l)：称取三羟甲基氨基甲烷 60.5 g，加入标准稀释水约 900.0 ml 溶解，用盐酸溶液（6.3.1）调节 pH 值至 8.21，并加入标准稀释水定容至1000 ml，于 28保存。6.4.3 N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)储备溶液(1.0 mg/ml)：称取 N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)10.0 mg，用少量二甲基亚砜溶液溶解并加入三(羟甲基)氨基甲烷(
9、Tris-HCL 缓冲液)(6.4.2)稀释定容至 10 ml，于 4保存。6.4.4 N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物(Compoud 48/80)标准储备溶液(100.0g/ml)：称取标准物质 N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物(Compoud 48/80)10.0 mg，用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至 100 ml，于 4 保存。6.4.5 色甘酸钠标准储备溶液(100.0 g/ml)：称取标准物质色甘酸 10.0 mg，用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至 100 ml，于 4 保存。6.5 对照组溶液6.5.1 空白对照组：标准稀释水。标准稀释水配置方法：精密称
10、取 17.2 g 氯化钠，0.76 g 氯化钾，2.9 g 氯化钙，4.9 g 硫酸镁，用蒸馏水或去离子水溶解并定容至 1000 ml。取以上标准稀释水储备液 16.67 ml，再用蒸馏水或去离子水稀释至 1000 ml 即可。6.5.2 溶剂（阴性）对照组：二甲基亚砜溶液（1%），水溶性样品无溶剂对照组。6.5.3 阳性对照组：色甘酸钠标准储备溶液(100.0 g/ml)。7.仪器设备7.1 斑马鱼养殖系统：包括制水、储水、供水、排水及水循坏系统。7.2 连续变倍体视显微镜（带拍照功能）：最小放大倍数为目镜 230，物镜 1。7.3 恒温培养箱：温度调至 280.5。7.4 冰箱：冷藏室 2
11、 8；冰冻室-18。全国团体标准信息平台7.5 电子天平：精度 0.1 mg。7.6 pH 计：测量范围 014,最小分度为 0.01 pH 单位。7.8 移液枪：0.5 l10 l、10 l100 l、100 l1000 l、1000 l5000 l。7.8 温度计：050。7.9 全波长酶标仪。7.10 实验室一般常规器材。8.实验过程8.1 胚胎准备斑马鱼配种时，产卵盒外缸预先加入 2/3 的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。于实验前一天晚上选取大于 4 个月的性成熟的待配种斑马鱼按照 1:1 或 1:2 的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中过夜，避光。次日早晨打
12、开光源，抽出产卵盒的挡板使之进行交配产卵。交配 1 h 后，检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集斑马鱼交配产生的胚胎,养殖水冲洗置 100.0 mm 培养皿中，平均每个培养皿胚胎数量不超过 300 枚。清除培养皿中的异物后，放入恒温培养箱里孵育。8.2 样品前处理参考附录 C 化妆品及原料前处理方法。8.3 实验方法在体式显微镜下随机挑选发育正常的 72 hpf 胚胎于 96 孔细胞培养板中，每孔加入胚胎 10 尾，每组设置 3 个平行组，分别设置空白对照组、模型对照组、阳性对照组和受试样品组。受试样品组加入受试样品溶液 100.0 l，阳性对照组加入色甘酸钠(100.0 g/ml)实验溶液 1
13、00.0 l，模型对照组和空白对照组加入标准稀释水 100.0 l，溶剂对照组加入二甲基亚砜（1%）100.0 l（水溶性样品无溶剂对照组），置于恒温培养箱孵育 2 h。孵育完成后，受试样品组、模型对照组和阳性对照组分别加入 Compoud 48/80 溶液(10.0 g/ml)100.0 l，空白对照组和溶剂对照组各加入标准稀释水 100.0 l，置于恒温培养箱孵育 90 min。孵育完成后，分别取各实验组上清液 100.0 l 至新的 96 孔细胞培养板，同时各实验浓度组加入BAPNA 储备溶液(1.0 mg/ml)100.0 l。另每孔加入 BAPNA 储备溶液(1.0 mg/ml)20
14、0.0 l，做为调零对照组。置于恒温培养箱 37 孵育 24 h。孵育完成后，置于酶标仪 405 nm(波长)下测试吸光度。9.结果计算9.1 分别计算各组别中每个平行组的胚胎 Tryptase 表达水平和抑制率。a）Tryptase 表达水平的计算公式如下：b）Tryptase 抑制率的计算公式如下：式中：OD酶标仪下测试样品吸光度。结果保留小数点后三位9.2 使用 GraphPad Prism 8 统计分析软件（或类似功能的其它工具）对各组别中 Tryptase 表达水平和全国团体标准信息平台抑制率进行统计分析，数值用均值标准误（MeanSEM）表示。10.质量控制10.1 空白对照试验和
15、溶剂对照试验空白对照试验和溶剂对照试验结果符合下列要求，结果方有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）空白对照组和溶剂对照组中 Tryptase 表达水平应明显低于模型对照组，数据具有统计学意义。10.2 模型对照试验模型对照试验试验结果符合下列要求，结果方有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）模型对照组的 Tryptase 表达水平应明显高于溶剂对照组，数据具有统计学意义。10.3 阳性对照试验阳性对照试验结果符合下列要求，结果方有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）阳性对照组中 Tryptase 表达水平应明显低于模型对照组，数据具有统计学意义。11.废弃物处置试验用斑马鱼胚于
16、28 冰水中灭活处理后按一般废弃物处置。具有急性毒性的样品、含有 3,4-二氯苯胺的废液按危险废物处置。全国团体标准信息平台附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图0 hpf（合子期）68 hpf（原肠期）24 hpf（体节期）48 hpf（孵化期）72 hpf（幼鱼）全国团体标准信息平台附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图外缸：225*115*115 mm内缸 220*110*85 mm挡板、外盖斑马鱼配种胚胎收集培养皿全国团体标准信息平台附录 C（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法D1.水溶性样品前处理方法使用标准稀释水直接将受试样品倍比稀释（稀释比为 2）成连续多个适当实验浓度，现配现用。D2.非水溶性样品前处理方法取适量的二甲基亚砜将样品溶解，用蒸馏水或去离子水定容成一定浓度的受试样品储备液，再将受试样品储备液倍比稀释（稀释比为 2）成连续多个适当实验浓度，现配现用。二甲基亚砜在实验溶液中的最终浓度1%，具体依据样品的溶解度而定。全国团体标准信息平台附录 D（资料性附录）数据记录表斑马鱼过敏试验记录表样品信息试验时间_年_月_日 至 _年_月_日仪器名称及型号结果显示Tr
