1、以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0.0 1C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 8 72 0 2 1 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f L e t t u c e m o s a i c v i r u s2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准12027835 T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准莴苣花叶病毒检疫鉴定方法S N/T 5 3 8 72 0 2 1
2、*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 0 9网址 www.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数2 5千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 7 9 定价1 6.0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。
3、本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、兰州海关技术中心、中华人民共和国吴江海关、福建省农业科学院果树研究所。本文件主要起草人:张永江、文朝慧、黄洁芳、谢丽雪、向均。S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准莴苣花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了莴苣花叶病毒的检疫鉴定方法。本文件适用于莴苣种子、莴苣、豌豆、鹰嘴豆等寄主植株上莴苣花叶病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本
4、(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法S N/T 2 1 2 2 进出境植物及植物 产品检疫抽样S N/T 3 4 5 7 植物病毒分子生物学检测规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1反转录重组酶聚合酶扩增 r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e c o m b i n a s e p o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n;R T-R P A一项等温扩增技术。R P A是在单链D NA结合蛋白(s i n g l e-s t r a
5、 n d e d D NA b i n d i n g p r o t e i n,S S B)的作用下,使模板D NA解链,并在D NA聚合酶的作用下,引物与模板正确配对形成复合体,然后D NA聚合酶延伸引物生成新的D NA互补链,实现对D NA的特定区域进行指数扩增。R T-R P A 以样品R NA为模板,先反转录成c D NA,然后再以c D NA为模板,进行R P A扩增。4 莴苣花叶病毒基本信息学名:L e t t u c e m o s a i c v i r u s缩写:LMV分类地位:马铃薯Y病毒科(P o t y v i r i d a e),马铃薯Y病毒属(P o t y
6、 v i r u s)。传播途径:汁液易于传毒;莴苣、昆诺阿藜种子传毒率3%1 3%;可通过蚜虫传播侵染豌豆,但豌豆种子不传毒。莴苣花叶病毒的其他信息参见附录A。5 方法原理 LMV的免疫原性和基因组特征是该病毒鉴定的依据。依据LMV与抗体间的特异性反应,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)和免疫试纸条检测;依据LMV的基因组特征建立R T-P C R和反转录重组酶聚合酶扩增技术(R T-R P A)检测方法;通过这些方法的有效组合,判断样品是1S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准否带有LMV。6 仪器设备、用具及试剂6.1 仪器设备 电子
7、天平(1/1 0 0 0 g)、小型离心机、恒温水浴锅、酶标仪、台式冷冻机、P C R仪、电泳仪、凝胶成像系统、金属浴、制冰机、常规冰箱、超低温冰箱、涡旋振荡器等。6.2 用具 可调移液器(0.1 L2.5 L,2 L2 0 L,1 0 L1 0 0 L,2 0 L2 0 0 L,1 0 0 L1 0 0 0 L)和可调移液器头(1 0 L,2 0 L,1 0 0 L,2 0 0 L,1 0 0 0 L),研钵,微型磨杵。6.3 试剂试验用水应符合G B/T 6 6 8 2的要求。双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂符合附录B要求,R T-P C R试剂符合附录D要求,R T-R P A符合附录E要
8、求。7 样品制备7.1 莴苣种子 莴苣种子用5倍1 0倍体积(mL)抽提缓冲液研磨后,3 0 0 0g离心取上清,进行D A S-E L I S A和免疫试纸条检测,种子取样量按照S N/T 2 1 2 2进行;另取3 5 0 L上清液提取核酸或用种子直接提取核酸后进行R T-P C R和R T-R P A检测。7.2 植物样品 有症状植株(叶片花叶、植株矮化),每株单独编号并采集症状部位制样;无症状植株,5株为一组编号并混合制样,按照S N/T 3 4 5 7进行。按1 g样品加入5 mL1 0 mL抽提缓冲液进行研磨,3 0 0 0g离心取上清,进行D A S-E L I S A和免疫试纸
9、条检测;或提取核酸后进行R T-P C R和R T-R P A检测。8 检疫鉴定方法8.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)把制备的样品上清液加入已包被LMV抗体的酶联板中,进行D A S-E L I S A检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照,感染LMV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作按照附录B执行。8.2 免疫层析试纸条检测免疫层析试纸条检测的对照设置见8.1,具体操作按照附录C执行。8.3 R T-P C R检测 R T-P C R检测阴性和阳性对照
10、设置见8.1,灭菌双蒸水(d d H2O)作为空白对照。分别提取样品和2S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准对照总R NA,反转录合成c D NA后进行P C R检测,具体操作按照附录D执行。如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。8.4 R T-R P A检测 R T-R P A检测阴性和阳性对照设置见8.1,灭菌双蒸水(d d H2O)作为空白对照。分别提取样品和对照总R NA,进行R T-R P A检测,具体操作按照附录E执行。如采用商品化试剂盒,则按照试剂盒说明进行。9 结果判定 样品经D A S-E L I S A、试纸条、R T-P C R或R T-R
11、P A中任一方法的检测,结果为阴性,判定样品不带有莴苣花叶病毒。样品经D A S-E L I S A或试纸条检测结果为阳性,还需用R T-P C R或R T-R P A进行检测。分子生物学检测结果为阴性,判定待检样品不带有莴苣花叶病毒;分子生物学检测结果为阳性,则判定样品带有莴苣花叶病毒。1 0 结果记录与样品保存1 0.1 结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。D A S-E L I S A检测应有酶联反应数值;免疫层析试纸条检测应有试纸条检测图片;R T-P C R和R T-R P A检测应有电泳图片。1 0.2 样品保存 阳性样品直接放于-8 0 冰
12、箱或冷冻干燥后放于-8 0 冰箱保存1年,保存的样品要做好标记和登记工作,以备复验、谈判和仲裁。保存期满后,需经灭活处理。3S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A (资料性)莴苣花叶病毒其他信息A.1 寄主范围 自然寄主包括莴苣(L a c t u c a s a t i v a)、豌豆(P i s u m s a t i v u m)、苣荬菜(S o n c h u s b r a c h y o t u s)、鹰嘴豆(C i c e r a r i e t i n u m)、野芥(S i n a p i s a r v e n s i s)、菠菜(S p i n
13、 a c i a o l e r a c e a)、红花(C a r t h a m u s t i n c t o r i u s)、蓝眼菊属(O s t e o s p e r m u m s p p.)、勋章菊属(G a z a n i a s p p.)、柴胡(B u p l e u r u m f a l c a t u m)和耳叶金鸡菊(C o r e o p s i s a u r i c u l a t a)等。接种寄主包括莴苣、豌豆、鹰嘴豆、苋色藜(C h e n o p o d i u m a m a r a n t i c o l o r)、昆诺阿藜(C h e n o
14、p o d i u m q u i n o a)、千日红(G o m p h r e n a g l o b o s a)、红花(C a r t h a m u s t i n c t o r i u s)等。莴苣、昆诺阿藜种子传毒率为3%1 3%。A.2 地理分布 亚洲:阿富汗、中国、印度、伊朗、伊拉克、以色列、日本、约旦、黎巴嫩、马来西亚、叙利亚、土耳其、也门。非洲:埃及、加纳、肯尼亚、马拉维、毛里求斯、摩洛哥、塞拉利昂、南非、坦桑尼亚、突尼斯、赞比亚、津巴布韦。欧洲:奥地利、比利时、克罗地亚、丹麦、芬兰、法国、德国、希腊、匈牙利、爱尔兰、意大利、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、斯洛文
15、尼亚、西班牙、瑞典、瑞士、英国。美洲:加拿大、墨西哥、美国、牙买加、阿根廷、巴西、智利、厄瓜多尔、乌拉圭。大洋洲:澳大利亚、新西兰。A.3 危害症状 莴苣:受侵染的莴苣症状多变,但通常表现为花叶、明脉和黄斑驳。常有叶脉坏死并呈古铜色。病株不能包心,里面的叶片持续短小,呈丛簇状,植株严重矮缩。见图A.1、A.2。豌豆:花叶。鹰嘴豆:叶黄化。苋色藜:接种8 d 1 0 d后,出现淡绿或褪绿色的局部斑,往往边缘呈淡红色,特别在冬季呈系统黄脉斑点,或嫩叶上有黄色网纹。昆诺阿藜:比苋色藜敏感,产生更多的局部病斑,但无淡红色边缘,后来随着顶叶的扭曲和矮化显现系统的黄色网脉症状。千日红:接种4 d 7 d产
16、生灰白色局部坏死斑点,扩大成红边的病斑,无系统侵染。本氏烟:系统花叶。红花:系统花叶。4S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准图A.1 LMV在莴苣(左)和本氏烟(右)上引起的系统性轻花叶症状(图A.1 引自L i m S,e t a l.)图A.2 LMV 在莴苣叶片(左)和茎秆(右)上引起花叶症状(图A.2 引自S h a r m a P,e t a l.)A.4 基因组 病毒粒体线状,大小约7 5 01 3 n m。基因组核酸为正单链R NA,组分单一,约有1 0 0 0 0个核苷酸组成。目前G e n B a n k已登录有LMV全基因组序列,不同分离物的外壳蛋白的C-端极其保守,可用于设计特异性引物进行检测。见图A.3。图A.3 病毒粒体(3 6 0 0 0)(图A.3引自周雪平,等)5S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 B(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)B.1 试剂B.1.1 包被抗体特异性的莴苣花叶病毒抗体,抗体效价应高于1/1 2 8 0 0 0。B.1.2 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的莴
