1、 ICS 07.080 CCS CAQI A40 团体标准 植物源性产品物种鉴别基因条码技术Sanger 测序法 Identification of species in plant products by DNA barcoding Sanger sequencing 2021-12-15 发布 2022-01-01 实施 中国质量检验协会 发 布 T/CAQI 2412021 全国团体标准信息平台T/CAQI 2412021 I 前言 本文件参照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担
2、识别这些专利的责任。本文件由中国检验检疫科学研究院提出，由中国质量检验协会归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中检国控科技集团有限公司、谱尼测试集团股份有限公司、江苏奥迪康医学科技股份有限公司、上海翊辉生物科技有限公司、上海天能科技有限公司、北京六一生物科技有限公司、中检科（北京）测试技术有限公司、国正检验认证有限公司。本文件主要起草人：吴亚君、杨艳歌、庄雷、宋薇、韩建勋、宋曈、乐粉鹏、刘鸣畅、孟诚卫、王洪越、张智杰、袁吉泽、王慧婧、薛晓晶、王芳。全国团体标准信息平台T/CAQI 2412021 1 植物源性产品物种鉴别基因条码技术 Sanger 测序法 1 范围 本文件规定了基因条
3、码技术Sanger测序法的原理、主要试剂、主要仪器设备、样品采集与制备、检验步骤、质量控制、结果判定与表述、检验过程中防止交叉污染的措施。本文件适用于植物源性食品、农产品、化妆品、中药材等产品的植物性原料物种的定性检测。注1：物种参见资料性附录A。注2：方法的检出限为5%10%（质量比）。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测核酸提
4、取纯化方法 GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 基因条码 DNA barcode 指生物体一段公认的能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2 Sanger 测序法 sanger sequencing 用于基因测序的双脱氧链末端终止法，在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的核苷酸链，通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。全国团体标准信息平台T/CAQI 2412021 2 3.3 基因条码技术 DNA barcoding
5、采用基因测序技术对物种的基因条码进行识别，利用其种内特异性和种间多样性实现对物种的快速鉴定的技术。3.4 质量评分 quality value（QV）仪器测序过程中，软件分析测序信号时，根据预测到的碱基解读错误率，给出针对每个碱基所对应的质量评分，用以评估单个碱基的测序质量。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BOLD：生命条形码数据系统（The Barcode of Life Data System）bp：碱基对（Base pair）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrithylammonium bromide）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）dN
6、TP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate）ddNTP：双脱氧核糖核苷三磷酸（Dideoxyribonucleoside triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）NCBI：美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）Taq DNA聚合酶：耐热DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）Tris：三羟甲基氨基甲烷 Tris(hydroxymethyl)aminomethane 5 原理 基于
7、基因条码技术，根据样品类型选择基因条码引物，扩增基因条码序列并双向测序，在数据库中对序列进行比对，确定物种。6 主要试剂 全国团体标准信息平台T/CAQI 2412021 3 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。Taq DNA 聚合酶。6.1 DNA 提取试剂盒。6.2 胶回收试剂盒。6.3 分子量标准品（最小片段100 bp，最大片段1000 bp）。6.4 琼脂糖。6.5 溴化乙锭或同类染色试剂。6.6 三氯甲烷。6.7 异丙醇。6.8 无水乙醇。6.9 dNTP 混合液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。6.10 10 PCR 缓冲液。
8、6.11 70%乙醇。6.12 1.2 mol/L NaCl 溶液。6.13 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液。6.14 10 电泳缓冲液：Tris 54 g/L，硼酸 27.5 g/L，10 mmol/L EDTA，pH 8.0。6.15 CTAB 提取液：20.00 g/L CTAB，81.9 g/L NaCl，12.1 g/L Tris，7.50 g/L Na2EDTA，pH 8.0。6.16 CTAB 沉淀液：5.00 g/L CTAB，2.50 g/L NaCl，pH 8.0。6.17 7 主要仪器设备 PCR 仪。7.1 凝胶成像仪。7.2 电泳仪。7.3 离心机：离心力 170
9、00 g。7.4 核酸蛋白分析仪。7.5 Sanger 测序仪。7.6 组织研磨器。7.7 全国团体标准信息平台T/CAQI 2412021 4 涡旋混匀仪。7.8 8 样品抽样与制备 总则 8.1 8.1.1 抽样及制备环境应清洁、卫生。抽样器具、制样器具及样品容器所用材质等应保持清洁，不应对待抽取样品造成污染。8.1.2 应在物理隔离的区域制备样品，防止对其他区域或实验室的污染，并应及时清洁制样区域。必要时使用 DNA 销毁剂处理抽样和制样器具和设备、样品容器及制样区域。8.1.3 样品数量应能满足检验项目对试样量的需要。一般应当一式三份，分别供检验、复验、留存备查或者仲裁之用。抽样 8.
10、2 8.2.1 抽样方法 8.2.1.1 目的国（地区）对抽样方法有要求的，按目的国（地区）要求抽样。8.2.1.2 目的国（地区）无要求的可按照相应产品标准规定的抽样要求抽样。8.2.1.3 目的国（地区）和我国产品标准无要求的，可参照以下原则抽样：a)抽取粉末样品和固体样品时，应均匀布点抽样。如果可能，在每个抽样点抽取整个深度的样品。b)抽取液体样品时，应在载货容器上中下三层抽取样品。8.2.2 抽样数量 100件以下抽5件，不足5件的全数抽取，100件以上按式(1)计算抽取件数：S=2 (1)式中：S抽样件数。N全批总件数。注：抽样件数取整数，小数部分向上修约。全国团体标准信息平台T/C
11、AQI 2412021 5 制备 8.3 8.3.1 总则 从抽取的样箱中每箱抽取不少于1瓶（袋、盒）样品，总数不少于3瓶（袋、盒），总量不少于500 mL或500 g。样品充分混匀，分成三等分，作为检样、复检样和贮存样，样品的制备应防止交叉污染和组分改变。8.3.2 粉末样品 混匀后直接分装，分装于适当规格的样品容器（50 mL离心管或密封袋）中得到实验室样品，4 C8 C保存。8.3.3 液体样品 液态样品摇匀，直接分装于适当规格的样品容器中，或通过必要的混合和缩分，将原始样品制备成实验室样品后，-20 C以下冻存。8.3.4 固体样品 固态样品表面依次用70%乙醇和无菌双蒸水冲洗2 3次
12、，晾干，研磨破碎，分装于适当规格的样品容器（50 mL离心管或密封袋）中得到实验室样品，4 C 8 C保存。9 检验步骤 实验设置 9.1 检测设置阳性对照和空白对照（无菌双蒸水），其中阳性对照和空白对照DNA提取1次，待检样品提取设置2个重复；所有DNA样品的PCR扩增设置2个重复。DNA 提取 9.2 按GB/T 19495.3-2004附录C中C.6.2 CTAB-2中的试验方法，并根据实际需要加入2 mL10 mL CTAB提取液，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液；同时加入20 L 100 L 10 mg/mL蛋白酶K（蛋白含量高的样品，用量增加一倍），6
13、5 C温育1 h 2 h（或过夜），期间不时震荡混匀。最后用50 L 100 L无菌双蒸水溶解DNA，混匀，-20 C以下冻存。全国团体标准信息平台T/CAQI 2412021 6 上述方法均可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。DNA 浓度和纯度的测定 9.3 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式（1）计算，每个样品重复测三次，取平均值。通过A260/A280比值判断提取出的DNA的纯度。若A260/A280值在1.72.1之间，说明DNA纯度较高。C=A N 50/1 000 (2)式中：CDNA浓度，单位为
14、微克每微升（g/L）；A260 nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。PCR 扩增 9.4 9.4.1 引物 扩增和测序引物见附录A。9.4.2 反应体系 采用Taq DNA聚合酶扩增，酶及扩增体系见附录C中C.1。9.4.3 反应参数 rbcL基因：95预变性10 min；95变性30 s，50退火30 s，72延伸30 s，40个循环；72再延伸5 min；4保存。psbA-trnH基因：95 C预变性4 min；94 C变性30 s，55 C退火1min，72 C延伸1 min，40个循环；72 C再延伸10 min；4保存。ITS基因：94 C预变性5 min；94 C变性30 s，56 C
15、退火30 s，72 C延伸45 s，40个循环；72 C再延伸10 min；4保存。matK基因：94预变性1 min；94变性30 s，52退火20 s，72延伸50 s，40个循环；72再延伸5 min；4保存。全国团体标准信息平台T/CAQI 2412021 7 9.4.4 电泳检测 取2 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将25 L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，同时点加分子量标准品，9 V/cm电泳仪中恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。用凝胶成
16、像仪观察电泳结果并记录。9.4.5 胶回收及 PCR 产物纯化 胶回收及PCR产物纯化见附录C中C.2。克隆纯化（适用于多组分和未知样品）9.5 一般地，PCR扩增后，电泳检测时，如发现多条扩增带，但不能用切胶回收方式加以区分的；或扩增时虽为单一条带，但测序时发现有多峰现象，则都提示可能为混合样品，需进行克隆纯化，再测序。克隆纯化方法见附录D中D.5。测序 9.6 测序步骤参见附录D中D.6。序列分析 9.7 使用序列拼接软件对双向序列进行拼接，去除标签序列和低质量区。将拼接后的序列在BOLD或NCBI数据库中进行序列比对，根据相似度判定物种。注1：BOLD网址：http:/www.boldsystems.org/注2：NCBI数据库网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/注3：rbcL和matK可以使用BOLD数据库，具体步骤为：BOLD数据库点击“鉴别”（IDENTIFICATION）选择“植物鉴别”（PLANT IDENTIFICATIONRBCLMATK）粘贴fasta格式的序列（Enter sequences in fasta format）点击“提交”（
