1、 ICS 67.050 CCS X04 中 国 营 养 保 健 食 品 协 会 团 体 标 准 T/CNHFA 0022022 乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊（山羊和绵羊）源性成分定性检测方法 实时荧光 PCR 法 Qualitative detection of bovine（Bos taurus,Bubalus bubalus and Bos grunniens）and ovine（Ovis aries and Capra hircus）derived ingredients in milk and dairy productsReal time PCR method 2022-0
2、6-22 发布 2022-07-01 实施 中国营养保健食品协会发布 发 布 T/CNHFA 0022022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由海普诺凯营养品有限公司提出。本文件由中国营养保健食品协会归口。本文件起草单位：海普诺凯营养品有限公司、中国检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院粤港澳大湾区研究院。本文件主要起草人：侯艳梅、杨艳歌、刘鸣畅、吴亚君、吴桐、王云帆、谢奎、王迎春、王洪越、王丹丹、吴占文、王帅。T/CNHFA 00
3、22022 1 乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊（山羊和绵羊）源性成分定性检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件规定了乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）、羊（山羊和绵羊）源成分以及家牛、牦牛、水牛、山羊、绵羊单一乳源成分的实时荧光PCR定性检测方法，方法的最低检出限为1%（配料质量比）。本文件适用于乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）、羊（山羊和绵羊）以及家牛、牦牛、水牛、山羊、绵羊源性成分的定性检测，适用的产品类别包括液态乳（巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、调制乳、灭菌乳、发酵乳）、乳粉（全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉、乳清粉）、婴幼儿配方乳粉等。2 规范性引用文件 下列文
4、件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 实时荧光 PCR Real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现对起始模板的定量及定性分析。3.2 Ct 值 Cycle threshold（Ct）每个反应
5、管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。4.1 CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。4.2 cytb：cytochrome b，线粒体细胞色素 b 基因。4.3 dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。4.4 dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。4.5 dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。4.6 DNA：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。4.7 d
6、NTP：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。4.8 dTTP：deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸。4.9 EDTA：Ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。4.10 GH：Growth Hormone，生长激素基因。T/CNHFA 0022022 2 4.11 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。4.12 Tris：Tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。4.13 Taq：Thermus aq
7、uaticus，水生栖热菌。4.14 UNG：uracil N-glycosylase，尿嘧啶 N-糖基化酶。5 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员检测，所有生物安全防护的设施、设备和安全管理的基本要求按照GB 19489有关规定执行。6 方法原理 基于实时荧光PCR的检测原理，采用哺乳动物通用和牛（家牛、牦牛和水牛）、羊（山羊和绵羊）、以及家牛、牦牛、水牛、山羊、绵羊单一乳源成分的特异性引物探针，对样品中提取的DNA模板进行实时荧光PCR反应。根据反应结果判定羊乳样品中是否含有牛（家牛、牦牛和水牛）、羊（山羊和绵羊）、以及家牛、牦牛、水牛、山羊、绵羊单一
8、乳源成分。7 仪器设备 7.1 实时荧光 PCR 仪。7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3 分析天平：精度 0.1 mg。7.4 水浴锅。7.5 离心机：离心力12000 g。7.6 微量移液器：0.5 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，100 L1000 L。7.7 涡旋混匀仪。7.8 恒温孵育器。7.9 pH 计。8 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。8.1 哺乳动物、牛（家牛、牦牛和水牛）、羊（山羊和绵羊）通用引物探针，以及家牛、牦牛、水牛、山羊、绵羊成分扩增引物
9、和探针详见表 1。表1 检测用引物和探针 名称 检测物种 引物序列（5-3）靶基因 扩增 长度 来源 质控 哺乳动物 F:CTCAGCAGGGTCTTCACCAACA R:TGCCTTCCTCTAGGTCCTTCAGC P:FAM-TGGTGTTTGGCACCTCGGACCGT-TAMRA GH 82 bp 本文件 牛 家牛、水牛和牦牛 F:GTTGCCAGCCATCTGTTGTTTG R:ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG P:FAM-TCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGG-TAMRA GH 81 bp 本文件 羊 山羊和绵羊 F:TGCCAGCCATCTGTTGTTA
10、CC R:AAAGGACAGTGGGCACTGGAG P:FAM-CCCGTGCCTTCCTAGACCCTGGAAG-TAMRA GH 79 bp 本文件 家牛 家牛 F:GCAGGCATGCTGGGGATG R:CTAAGAACCAGGAGCGTGGACAG P:FAM-TACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGG-TAMRA GH 135 bp 本文件 T/CNHFA 0022022 3 名称 检测物种 引物序列（5-3）靶基因 扩增 长度 来源 水牛 水牛 F:TTCATTGAYCTCCCTGCTCC R:GGAATAGGCCGGTGAGGATT P:FAM-ACTTTGGCT
11、CTCTCC-MGB cytb 100 bp SN/T3730.7-2013 牦牛 牦牛 F:AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA R:CGTCTCGGCAGATATGGACA P:FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-TAMRA cytb 124 bp BJS201904 山羊 山羊 F:GGAGGGAACTGAGGACCTCAGTG R:GGTGTGTGGTTCCCCTCACTG P:FAM-CCTTATTCGGAACCCTCCCCACCCCA-TAMRA GH 121 bp 本文件 绵羊 绵羊 F:CGGAGTAATCCTCCTATTTGC
12、R:CTAGGCTTGTGCCAATATATGGA P:FAM-TATTACCAACCTCCTTT-MGB cytb 137 bp GB38164-2019 8.2 三氯甲烷（氯仿）。8.3 异丙醇。8.4 Taq 酶：5 U/L。8.5 UNG 酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）。8.6 70%乙醇（V/V）。8.7 NaCl 溶液：1.2 mol/L，灭菌后室温贮存。8.8 MgCl2溶液：2.5 mmol/L，灭菌后室温贮存。8.9 dNTP 溶液（dGTP、dCTP、dATP、dTTP 或 dUTP）：各 2.5 mmol/L。8.10 蛋白酶 K 溶液：10 mg/mL，用 X mL 的无菌
13、水或者蛋白酶 K 缓冲液溶解 10X mg 蛋白酶 K 粉末（如用 5 mL 的无菌水或者蛋白酶 K 缓冲液溶解 50 mg 的蛋白酶 K 粉末），涡旋混匀制备成浓度为 10 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液，-20贮存。8.11 CTAB 提取液：20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02mol/L Na2EDTA，pH 8.0，灭菌后室温贮存。8.12 CTAB 沉淀液：5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl，灭菌后室温贮存。8.13 10 PCR 缓冲液：KCl 100 mmol/L，(NH4)2SO4 160 mmol
14、/L，MgSO4 20 mmol/L，Tris-HCl（pH 8.8）。8.14 实时荧光 PCR 反应混合液：12.5 L 反应体系包括 1 U2 U 的 Taq 酶、2 PCR 缓冲液、2.5 mmol/L4.0 mmol/L 的MgCl2、0.2 U1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d（A，C，G）TPs、0.2 mmol/L0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX 染料（某些荧光 PCR 仪不需要 ROX 校正）；也可用等效的实时荧光 PCR 预混液。9 检测步骤 9.1 样品前处理 9.1.1 乳粉 将样品充分混匀，取 3 g6 g，均分成三份，分
15、别为测试样品、复检样品和保存样品，并装入离心管或密封袋中，加封后，标明标记，4储存。9.1.2 液态乳 将样品充分混匀，分别取30 mL60 mL，均分成三份，分别为测试样品、复检样品和保存样品，并装入离心管或密封袋中，加封后，标明标记，4储存。以上前处理过程中应小心操作，确保防止任何交叉污染和样品组分的改变。9.2 DNA 提取 取处理好的样品（固体1 g2 g，液体10 mL20 mL）于50 mL离心管中，固体加入3 mL5 mLCTAB提取液，液体加入等体积的CTAB提取液，60 L100 L蛋白酶K（10 mg/mL）；置于65恒温孵育器中500 rpm1000 rpm震荡孵育2 h
16、左右（或200 rpm300 rpm震荡孵育过夜）；取出后13000 g离心10 min，T/CNHFA 0022022 4 小心用洁净纸刮去表面油脂，转移清液至50 mL超速离心管中；加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下13000 g离心10 min；每次转移800 L上清液至1.5 mL离心管中，每管加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下13000 g离心10 min；每次转移700 L上清液至1.5 mL离心管中，每管加入等体积CTAB沉淀液混匀，13000 g离心10 min；弃上清，加入350 L 1.2 mol/L NaCl溶液，充分溶解沉淀；加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20放置0.5 h1 h，13000 g离心10 min15 min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 g离心10 min，弃上清，室温下晾干。每管加入20 L50 L双蒸水溶解沉淀，多管合并到1管混匀，-20保存。也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。9.3 DNA 浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测2
