1、抗生素菌渣及有机肥基料、作物、环境介质中红霉素检测方法 Method for determination of erythromycin in antibiotic fermentation residue,raw fertilizer material,crop,and related environments（发布稿）2021-08-01 发布 2021-08-01 实施 中国化学制药工业协会 发 布PIAC 中国化学制药工业协会团体标准 T/PIAC 000032021 全国团体标准信息平台T/PIAC 000032021 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2020的规则起草。本标
2、准由中国家环境保护抗生素菌渣无害化处理与资源化利用工程技术中心提出。本标准由中国化学制药工业协会归口。本文件起草单位：国家环境保护抗生素菌渣无害化处理与资源化利用工程技术中心、中国环境科学研究院、北京农业生物技术研究中心、同济大学、中国科学院生态环境研究中心、清华大学、新疆大学、哈尔滨工业大学、常州大学、中广核达胜科技有限公司。本文件主要起草人：沈云鹏、任立人、田书磊、贾殿赠、刘惠玲、张昱、王建龙、王旭明、潘广成、雷英、邓留杰、董丽萍、王鲁香、任建军、刘宏博、戴晓虎、蔡辰、韩子铭、冯皓迪、初里冰、邓葵、刘尊奇、刘胜辉、周春华、张远斌、冯书娟、刘希禹、张幼学、殷文娟、刘淑云、陈启军、地尔夏提.艾
3、沙江、李志杰。本标准首批承诺执行单位：国家环境保护抗生素菌渣无害化处理与资源化利用工程技术中心、中国环境科学研究院、北京农业生物技术研究中心、同济大学、中国科学院生态环境研究中心、清华大学、新疆大学、常州大学、新疆农业大学、新疆环境科学研究院、伊犁州环境监测站、伊犁州检验检测认证研究院、伊犁川宁生物技术股份有限公司。全国团体标准信息平台T/PIAC 000032021 II 目目 录录 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 抗生素菌渣及有机肥基料中红霉素 A 的测定 液相色谱法.1 3.1 原理.1 3.2 试剂和材料.1 3.2.1 试剂.1 3.2.2 试剂配制.2 3.2.3 标准品
4、.2 3.2.4 标准溶液配制.2 3.2.5 材料.2 3.3 仪器设备.3 3.4 样品.3 3.5 分析步骤.3 3.5.1 提取.3 3.5.2 净化.3 3.5.3 测定.3 3.5.4 加标实验.4 3.5.5 平行试验.4 3.6 结果计算.4 3.7 准确度和精密度.5 4 土壤中红霉素 A 的测定 液相色谱-串联质谱法.6 4.1 原理.6 4.2 试剂和材料.6 4.2.1 试剂.6 4.2.2 试剂配制.6 4.2.3 标准品.6 4.2.4 标准溶液配制.6 4.2.5 材料.7 4.3 仪器设备.7 4.4 样品.7 4.5 分析步骤.7 4.5.1 提取.7 4.5
5、.2 净化.8 4.5.3 测定.8 4.5.4 加标实验.9 4.5.5 平行试验.9 4.6 结果计算与表述.9 4.6.1 定性测定.9 4.6.2 定量测定.9 4.7 精密度和准确度.10 5 作物中红霉素 A 的测定 液相色谱-串联质谱法.11 5.1 原理.11 5.2 试剂和材料.11 5.2.1 试剂.11 5.2.2 试剂配制.11 5.2.3 标准品.11 全国团体标准信息平台T/PIAC 000032021 III 5.2.4 标准溶液配制.11 5.2.5 材料.11 5.3 仪器设备.12 5.4 样品.12 5.5 分析步骤.12 5.5.1 提取.12 5.5.
6、2 净化.12 5.5.3 测定.12 5.5.4 加标实验.13 5.5.5 平行试验.13 5.6 结果计算与表述.13 5.6.1 定性测定.13 5.6.2 定量测定.13 5.7 精密度和准确度.14 6 水中红霉素 A 的测定 液相色谱-串联质谱法.15 6.1 原理.15 6.2 试剂和材料.15 6.2.1 试剂.15 6.2.2 试剂配制.15 6.2.3 标准品.15 6.2.4 标准溶液配制.15 6.2.5 材料.15 6.3 仪器设备.16 6.4 样品采集与保存.16 6.5 分析步骤.16 6.5.1 调节水样 pH.16 6.5.2 净化.16 6.5.3 测定
7、.16 6.5.4 加标实验.17 6.5.5 平行试验.17 6.6 结果计算与表述.17 6.6.1 定性测定.17 6.6.2 定量测定.17 6.7 精密度和准确度.17 7 大气中红霉素 A 的测定 液相色谱-串联质谱法.18 7.1 原理.18 7.2 试剂和材料.18 7.2.1 试剂.18 7.2.2 试剂配制.18 7.2.3 标准品.18 7.2.4 标准溶液配制.18 7.2.5 材料.18 7.3 仪器设备.19 7.4 样品.19 7.5 分析步骤.19 7.5.1 预处理.19 7.5.2 测定.19 7.5.3 加标实验.20 7.5.4 平行试验.20 全国团体
8、标准信息平台T/PIAC 000032021 IV 7.6 结果计算与表述.20 7.6.1 定性测定.20 7.6.2 定量测定.20 7.7 精密度和准确度.20 附录 A.21 全国团体标准信息平台T/PIAC 000032021 1 抗生素菌渣及有机肥基料、作物、环境介质中 红霉素检测方法 1 1 范围范围 本标准规定了抗生素发酵生产过程产生的废菌丝体（抗生素菌渣）在进行无害化处理与资源化利用过程中红霉素 A 的检测方法。本标准适用于抗生素菌渣及无害化处理后制备的有机肥基料、作物、环境介质（土壤、水、大气）中红霉素 A 的检测。本方法检出限分别为：抗生素菌渣及有机肥基料中红霉素 A 0
9、.29 mg/kg；土壤中红霉素 A 16.0 g/kg；作物中红霉素 A 16.0 g/kg；水中红霉素 A 0.05 g/L；大气中红霉素 A 0.01 g/m。2 2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分，总则与定义 GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分，确定标准测量方法重复性和再现性的基本方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格
10、和试验方法 HJ/T 166-2004 土壤环境监测技术规范 3 3 抗生素菌渣及有机肥基料中红霉素抗生素菌渣及有机肥基料中红霉素 A 的测定的测定 液相色谱法液相色谱法 3.1 原理 试样中红霉素 A 经乙腈-Tris-CaCl2溶液提取，固相萃取小柱净化处理后，高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。3.2 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。3.2.1 试剂 3.2.1.1 甲醇。全国团体标准信息平台T/PIAC 000032021 2 3.2.1.2 超纯水：18.2 Mcm，25。3.2.1.3 乙腈：色谱纯。3.2.1.4 磷酸氢二
11、钾。3.2.1.5 磷酸。3.2.1.6 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。3.2.1.7 氯化钙。3.2.1.8 氢氧化钠。3.2.1.9 盐酸。3.2.2 试剂配制 3.2.2.1 Tris-CaCl2溶液（pH=6）：准确称取1.21 g Tris，2.22 g CaCl2，用水溶解，用磷酸调节pH至6，并用水定容至1000 mL。3.2.2.2 乙腈-Tris-CaCl2溶液：乙腈Tris-CaCl2=82（v/v）。3.2.2.3 0.03 mol/LK2HPO4溶液：准确称取6.8466 g K2HPO43H2O，用水溶解，调节pH至10，并定容于1000 mL容量瓶中。3.2.2.4
12、 稀盐酸：1M，量取10 mL分析纯盐酸，用水定容至100 mL。3.2.2.5 稀氢氧化钠：1M，称取4 g分析纯氢氧化钠，用水定容至100 mL。3.2.3 标准品 3.2.3.1 红霉素A标准品：Erythromycin A，C37H67NO13，CAS号：114-07-8，纯度95%。3.2.4 标准溶液配制 3.2.4.1 红霉素A标准贮备溶液（1000 mg/L）：准确称取 100 mg（精确至 0.1 mg）红霉素A标准品，用甲醇（3.2.1.1）溶解并定容至100 mL。4密封保存，有效期3个月。3.2.4.2 空白样品提取液：称取空白试样，按照3.5.1预处理方法制备。3.2
13、.5 材料 3.2.5.1 固相萃取柱（二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮的大孔共聚物-HLB柱或相当者）：500 mg/6 mL。使用前依次通过5 mL甲醇及5 mL水预处理活化，保持柱体湿润。3.2.5.2 微孔滤膜：0.22 m，有机系。全国团体标准信息平台T/PIAC 000032021 3 3.2.5.3 聚丙烯离心管：50 mL、15 mL。3.2.5.4 试验筛：0.5 mm。3.3 仪器设备 3.3.1 高效液相色谱仪，配紫外检测器。3.3.2 电子天平，感量0.0001 g。3.3.3 离心机。3.3.4 pH计：测量精度 0.02。3.3.5 固相萃取装置。3.3.6 氮吹仪。
14、3.3.7 超声波清洗器。3.3.8 涡旋振荡器。3.4 样品 3.4.1 样品制备 液态抗生素菌渣直接称量即可，菌渣的干制品和有机肥基料需研磨，过筛（0.5 mm）。3.4.2 样品保存 样品于冷藏箱保存（28）。3.5 分析步骤 3.5.1 提取 称取样品约1 g（精确至0.0001 g），于50 mL聚丙烯离心管中，加入15 mL乙腈-Tris-CaCl2溶液，涡旋振荡1 min，超声辅助提取30 min，以4000 rpm离心10 min，取上清液。重复操作一次，合并上清液，使用稀盐酸溶液或者稀氢氧化钠溶液调节pH至6.8-7.0，用水将提取液定容至250 mL。3.5.2 净化 将上
15、述提取液以5 mL/min的流速通过已活化的固相萃取柱，用5 mL水淋洗萃取小柱，弃去全部流出液。减压抽干5 min，用6 mL甲醇溶液洗脱目标物，洗脱液置于氮吹仪上吹至近干，用1 mL甲醇复溶残渣，经0.22 m有机系滤膜过滤后，待测。3.5.3 测定 全国团体标准信息平台T/PIAC 000032021 4 3.5.3.1 液相色谱检测条件 a)色谱柱：C18，4.6 250 mm，5 m，或能力相当者；b)柱温：35；c)进样量：10 L；d)检测波长：215 nm；e)流动相及梯度洗脱条件，见表1。表 1 流动相及梯度洗脱条件 时间/min 流速/(mL/min)流动相A（乙腈）/%流
16、动相B（0.03 M K2HPO4溶液）/%0.00 1.0 55 45 25.00 55 45 25.01 90 10 35.00 90 10 35.01 55 45 45.00 55 45 3.5.3.2 工作曲线 从红霉素A标准贮备溶液中分别取0 mL、0.5 mL、1 mL、5 mL、10 mL、20 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，最终获得系列标准溶液浓度为：0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L，以浓度和相应峰面积值为x轴、y轴绘制工作曲线，外标法进行定量。3.5.3.3 样品检测 试样溶液直接（或适当稀释后）与系列标准溶液在相同条件下检测，由工作曲线计算出相应红霉素A的含量。3.5.4 加标实验 参照GB/T 6379.1和GB/T 6379.4进行验证实验，添加1.0 mg/kg标准品到试样中，按以上步骤提取和检测，计算试样本底抗生素浓度和加标后抗生素浓度。3.5.5 平行试验 参照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2进行验证实验，做两份试样的平行试验。3.6 结果计算 采用工作曲线法定量。按下式
