1、 ICS 65.020.01CCS B 04 ICS 65.020.01CCS B 04 团 体 标 准团 体 标 准 T/N A I A 0 2 6 2 0 2 1T/NAIA 0206-2023食用菌中游离氨基酸的测定液相色谱-质谱联用法食用菌中游离氨基酸的测定液相色谱-质谱联用法Determination of free amino acids in edible fungi Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2023-04-28 发布2023-05-01 实施 宁夏化学分析测试协会 宁夏化学分析测试协会 发 布发
2、 布发布TB全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、宁夏农林科学院园艺研究所。本文件主要起草人：赵子丹、牛艳、王晓静、开建荣、李冬、王晓菁、陈翔、闫玥、王海霞、吴燕、石欣、王彩艳、刘霞、杨静、张锋锋。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台 食用菌中游离氨基酸的测定 液相色谱-质谱联用法 1 范围 本文件规定了香菇、羊肚菌等食用菌中游离氨基酸含量的高效液相色谱-质谱联用测定方法。本文件适用
3、于香菇、羊肚菌等食用菌中 20 种游离氨基酸（蛋氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、组氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、-氨基丁酸）的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 术语和定义 无。4 原理 试样经甲醇溶液超声提取，通过液相色谱-质谱联用仪检测，外标法定量。5 试剂与材料 除非另有
4、规定外，所有试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682中规定的一级水。5.1 甲醇（CH4O）：色谱纯。5.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。5.3 甲酸（CH2O2）：色谱纯。5.4 50%甲醇溶液（50+50，体积比）：量取 50 mL 水加入 50 mL 甲醇中，混匀。5.5 0.1%甲酸溶液（体积分数）。5.6 氨基酸标准品：蛋氨酸 Met（CAS 号 63-68-3）、甘氨酸 Gly（CAS 号 56-40-6）、缬氨酸 Val（CAS 号 72-18-4）、色氨酸 Trp（CAS 号 73-22-3）、组氨酸 His（CAS 号全国团体标准信息平台 71-00-1）、丝氨酸 Ser（C
5、AS 号 56-45-1）、亮氨酸 Leu（CAS 号 61-90-5）、异亮氨酸 Ile（CAS 号 73-32-5）、苯丙氨酸 Phe（CAS 号 63-91-2）、苏氨酸 Thr（CAS 号 72-19-5）、丙氨酸 Ala（CAS 号 56-41-7）、脯氨酸 Pro（CAS 号 147-85-3）、酪氨酸 Tyr（CAS 号60-18-4）、天冬氨酸 Asp（CAS 号 56-84-8）、天冬酰胺 Asn（CAS 号 70-47-3）、精氨酸 Arg（CAS 号 74-79-3）、赖氨酸 Lys（CAS 号 56-87-1）、谷氨酰胺 Gln（CAS 号 56-85-9）、谷氨酸 G
6、lu（CAS 号 56-86-0）、-氨基丁酸（CAS 号 56-12-2），20 种氨基酸浓度均为 1000 mg/L。5.7 标准溶液配制：分别准确移取 0.1mL 的氨基酸标准溶液，用甲醇溶液（5.4）溶解，分别配制成 10 mg/L 的标准中间溶液，-18 下保存。6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2 分析天平：感量 0.01 g，0.0001g。6.3 组织捣碎机。6.4 高速粉碎机：10000 r/min。6.5 高速分散机。6.6 离心机：4000 r/min。6.7 涡旋混合器。6.8 滤膜：0.22 m，有机相。7 分析步骤 7
7、.1 试样的制备 新鲜的食用菌子实体样品，用破壁料理机打浆，干样用高速粉碎机粉碎，分别置于样品盒(袋)中，-18冷冻备用。7.2 样品提取 7.2.1 鲜样 称取试样 1.00 g（精确至 0.0001 g）于 50 mL 离心管，加入 40.0 mL 甲醇溶液(5.4)，经超声提取 30 min，于 4000r/min 离心 5min 后，吸取 2.00 mL 上清液过 0.22 m 滤膜，待测定。7.2.2 干样 称取试样 0.02 g（精确至 0.0001 g）于 50 mL 离心管，加入 40.0 mL 甲醇溶液(5.4)，经超声提取 30 min，于 4000r/min 离心 5mi
8、n 后，吸取 2.00 mL 上清液过 0.22 m 滤膜，待测定。7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 全国团体标准信息平台 a）色谱柱：C18柱，3.5 mm（内径）150 mm，粒径 4.6 m，或相当者；b）流动相：A 相为甲酸溶液（5.5），B 相为乙腈，流动相梯度条件见表 1；c）流速：0.3 mL/min；d）柱温：40；e）进样量：2 L。表 1 流动相及其梯度条件（VA+VB）时间 min VA%VB%0.00 98 2 2.0 98 2 14.0 2 98 15.0 2 98 15.1 98 2 18.0 98 2 7.3.2 质谱参考条件 a）离子源类型：电喷雾离子
9、源；b）扫描方式：正离子扫描；c）电喷雾电压：5500 V；d）离子源温度：550；e）喷雾气流速：55 L/h；f）气帘气流速：55 L/h；g）多反应监测：20种氨基酸的保留时间、母离子、子离子及离子对质谱参数见表2。表2 20种氨基酸的多反应离子监测质谱参数 中文名称 英文简写 保留时间 min 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能 V 谷氨酰胺 Gln 4.70 147.1/84.0 147.1/130.0 147.1/84.0 22 14 23 赖氨酸 Lys 4.71 147.1/84.1 147.1/130.0 147.1/84.1 22 14 24 组氨
10、酸 His 4.78 156.1/110.1 156.1/82.9 158.0/102.1 35 20 32 精氨酸 Arg 4.81 175.2/70.0 175.2/60.0 175.2/70.0 45 29 18 甘氨酸 Gly 5.02 76.2/30.0 76.2/30.0 29 15 天冬酰胺 Asn 5.05 133.1/74.0 133.1/87.0 133.1/74.0 35 15 21 丝氨酸 Ser 5.05 106.1/60.0 106.1/70.0 106.1/60.0 22 14 15 天冬氨酸 Asp 5.11 133.9/88.0 133.9/74.3 133.
11、9/88.0 35 14 18 丙氨酸 Ala 5.13 90.1/44.0 90.1/44.0 40 14 苏氨酸 Thr 5.17 120.1/74.1 120.1/56.0 120.1/74.1 25 14 20 全国团体标准信息平台-氨基丁酸 GABA 5.18 87.0/104.1 69.0/104.1 87.0/104.1 30 15 25 谷氨酸 Glu 5.20 148.2/84.1 148.2/102.0 148.2/84.1 20 14 22 脯氨酸 Pro 5.52 116.1/70.0 116.1/70.0 31 20 缬氨酸 Val 6.15 118.1/72.2 1
12、18.1/55.1 118.1/72.2 55 15 28 蛋氨酸 Met 7.74 150.2/104.0 150.2/133.0 150.2/104.0 45 15 15 酪氨酸 Tyr 9.43 182.1/165.0 182.1/136.1 182.1/165.0 50 15 20 异亮氨酸 Ile 10.61 132.1/86.1 132.1/69.1 132.1/86.1 35 15 25 亮氨酸 Leu 10.73 132.1/86.1 132.1/86.1 25 15 苯丙氨酸 Phe 11.18 166.1/120.1 166.1/103.0 166.1/120.1 40 2
13、0 40 色氨酸 Trp 11.70 205.1/146.0 205.1/118.0 205.1/146.0 30 25 35 7.3.3 色谱测定与确证 根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和试样中被测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述仪器条件下，食用菌中游离氨基酸的保留时间范围为 4.012.0 min，多反应离子监测色谱图参见附录 A。按照上述条件进行样品测定，若检测样品的色谱峰保留时间与标准品一致，且与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表 3 规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表 3 定性确证相对离子丰
14、度的最大允许偏差 相对离子丰度 50%20%至 50%10%至 20%10%允许的相对偏差 20%25%30%50%8 结果计算和表达 用色谱数据处理或按式（1）计算试样中各氨基酸的含量。（1）式中：X 试样中被测物残留量的数值，单位为毫克每千克（mg/kg）；A 试样溶液中被测物的质量色谱图峰面积；V 提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；CS 标准工作液中被测物的质量浓度的数值，单位为毫克每升（mg/L）；AS 标准工作溶液中被测物的质量色谱图峰面积；m 试样质量的数值，单位为克（g）。10001000SSA CVXAm全国团体标准信息平台 注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位
15、有效数字。9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合附录 B 的要求。10 定量限 方法定量限为 0.01 mg/kg。全国团体标准信息平台 附录 A（资料性）20种氨基酸多反应监测（MRM）质量色谱图 20种氨基酸多反应监测（MRM）质量色谱图见图A.1。图A.1 20种氨基酸多反应监测（MRM）质量色谱图 全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台 附录 B（规范性）实验室内重复性要求 实验室内重复性要求，见表B.1。表 B.1 实验室内重复性要求 被测组分含量 mg/kg 精密度(RSD)%0.010.1 20 0.11 15 1 10 全国团体标准信息平台
