1、ICS 01.040.67 X 04 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 25622015 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法（ELISA）Determination of esterase activity in Daqu Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)文稿版次选择 2015-12-30 发布 2016-01-30 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 25622015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、
2、安徽古井贡酒股份有限公司、安徽农业大学。本标准主要起草人：周庆伍、李安军、蒋军、汤有宏、江昌俊、梁绍勋、李晓欢、何宏魁、吴文睿、刘国英、汪君、李红歌、马侠。DB34/T 25622015 1 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法（ELISA）1 范围 本标准规定了大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法。本标准适用于大曲酯酶活力的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1
3、 酯酶活力单位 esterase activity unit 在 37、pH 6.0 条件下，15 min 水解-乙酸萘酯转化为-萘酚，每产生 1 nmol-萘酚为 1个酯酶 活力单位（U）。4 原理 试样中的酯酶与微孔中包被的羧酸酯酶抗体结合，在酶标记物的作用下，形成的酶标抗体抗原复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中酯酶活力。5 试剂和材料 5.1 本实验所用试剂除非另有说明，均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 二级水。5.2 酯酶试剂盒：28冰箱中保存。注：不同品牌的酯酶试剂盒其操作步骤可能有所不同，溶液配制和测试程序等可根据其试剂盒使用说明书略作调整。
4、5.2.1 包被羧酸酯酶抗体的聚苯乙烯微量反应板。5.2.2 羧酸酯酶标准品：450 U/L。5.2.3 羧酸酯酶标记物。5.2.4 羧酸酯酶标准品稀释液。5.2.5 试样稀释液。5.2.6 洗板母液。DB34/T 25622015 2 5.2.7 显色剂 A。5.2.8 显色剂 B。5.2.9 反应终止液。5.3 磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）：优级纯。5.4 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）：优级纯。5.5 氯化钠（NaCl）：优级纯。5.6 磷酸盐缓冲溶液：pH=7.4。分别称取 0.62 g 磷酸二氢钠(5.3)、5.73 g 磷酸氢二钠(5.4)和 9 g氯化钠(5.5)
5、，加水溶解至 1000 mL，在 pH 计上调节溶液 pH=7.4。5.7 羧酸酯酶标准溶液：根据酯酶试剂盒（5.2）的线性范围，用羧酸酯酶标准品稀释液（5.2.4）将羧酸酯酶标准品（5.2.2）稀释成不同活力的标准工作溶液，每次测定现配现用。5.8 洗涤液：将洗板母液（5.2.6）按照酯酶活力试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。6 仪器和设备 6.1 酶标仪（配备 450 nm 滤光片）。6.2 分析天平：感量 1 mg 6.3 冷冻离心机。6.4 振荡器。6.5 恒温培养箱。6.6 超声波细胞破碎仪。6.7 pH 计。7 测定步骤 7.1 粗酶液制备 7.1.1 称取 0.10.5 g
6、 试样，精确到 0.001 g，置于 100 mL 烧杯中，加 50 mL 磷酸盐缓冲溶液（5.6），振荡 10 min。将烧杯置于超声波细胞破碎仪（6.6）中，超声探头直径 68 mm、超声温度 48、超声时间 35 s、间歇时间 35 s、超声功率 300350 W、总超声时间 510 min，制成试样液。7.1.2 试样液于 48、5000 r/min 离心 10 min，取 1 mL 上清液于 250 mL 容量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液（5.6）至刻度，摇匀，制成粗酶液。保存过程中如有沉淀，应再次离心。7.2 测试程序 7.2.1 以下所有操作应在 2025室温下进行。7.2.2 酶标仪
7、测定条件：酶标仪测定波长 450 nm。7.2.3 酯酶试剂盒（5.2）中所有的试剂的温度均应回升到室温（2025）后方可使用。7.2.4 洗板条件 7.2.4.1 人工洗板次数 5 次以上，每次注水量 250 L。7.2.4.2 自动洗板可以设定 5 个周期。7.2.5 记录空白、标准品和试样在微孔板上的位置。7.3 测定 DB34/T 25622015 3 7.3.1 吸取 50 L 羧酸酯酶标准工作溶液（5.7）依次加入标准溶液孔底部。吸取 40 L 试样稀释液（5.2.5）加入试样孔底部，再加 10 L 粗酶液（7.1），混合均匀。7.3.2 封板膜封板后置于 37恒温培养箱（6.5）
8、中孵育 30 min。7.3.3 取出微量反应板，弃去液体，甩干，立即用洗涤液（5.8）按 7.2.4 条件进行洗板，每次静置30 s 后甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干。7.3.4 吸取 50 L 羧酸酯酶标记物（5.2.3）于空白孔外的每一个微孔。用封板膜密封孔口，于 37孵育 30 min。7.3.5 按 7.3.3 步骤重复操作。7.3.6 加入 50L 显色剂 A（5.2.7）和 50 L 显色剂 B（5.2.8）于每一个微孔底部，摇匀后于 37孵育 30 min。7.3.7 迅速加入反应终止液（5.2.9）50 L 于每一个微孔底部，摇匀（此时蓝色立转黄色）。7.3.8 将微量反应板置于
9、酶标仪（6.1）中，在 450 nm 处用空白孔调零点，测定吸光度(加入反应终止液后应在 15 min 内读取吸光度)。7.4 平行试验 按以上步骤同一标准溶液、同一样品溶液进行平行试验测定。7.5 空白试验 除不称取试样外，其它均按上述步骤进行。8 结果计算 以吸光度值为纵坐标，酯酶的活力（U/L）为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的酯酶活力，结果按公式（1）进行计算。.(1)式中：X-大曲酯酶活力，单位为活力单位/克（U/g）；C 从标准工作曲线上得到的试样酯酶活力，单位为活力单位/升（U/L）；V 试样液体积,单位为毫升(mL)；n 试样液稀释倍数；m 试样的质量,单位为克（g）。注：计算结果保留 2 位有效数字。9 精密度 重复测定结果的相对偏差不得超过 15。_
