1、 ICS 65.120 B 46 DB41 河南省地方标准 DB41/T 15882018 饲料中沙门氏菌的检测 EMA-PCR 法 2018-04-17 发布 2018-07-17 实施河南省质量技术监督局 发 布 河南省地方标准公共服务平台河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、河南中标检测服务有限公司。本标准主要起草人：张发旺、方忠意、董鹏、李金磊、李灵平、李博、于辉。本标准参加起草人：高延玲、狄元冉、韩楠、王艳丽、贾松涛、邱天宝、邱富娜、
2、王书丽、张跃京、张宁、王小艳、王丹。河南省地方标准公共服务平台河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 1 饲料中沙门氏菌的检测 EMA-PCR 法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的EMA-PCR检测方法。本标准适用于饲料中沙门氏菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检测方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 原理 叠氮溴化乙锭（E
3、MA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。4 试剂和材料 4.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合 GB/T 6682 一级水的要求。4.2 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录 A 的 A.1。4.3 氯化镁-孔雀绿增菌液（RV）：见附录 A 的 A.2。4.4 2Premix Taq缓冲液：内含Taq DNA 聚合酶 1.25 U/25 L，4 mmol Mg2+，dNTP 各 0.4 mmol。4.5 特异性引物(对)序列为：a）上游引物：5-GTG AAA TTA TCG CC
4、A CGT TCG GG-3；b）下游引物：5-CAT CGC ACC GTC AAA GGA AC-3。4.6 琼脂糖：电泳级。4.7 Marker 2000。4.8 沙门氏菌 ATCC 14028。4.9 50TAE 缓冲液：见附录 A 的 A.3。4.10 6上样缓冲液：见附录 A 的 A.4。4.11 叠氮溴化乙锭（EMA，0.2 mg/mL）：见附录 A 的 A.5。4.12 溴化乙锭（10 mg/mL）。4.13 灭菌离心管：1.5 mL，15 mL。5 仪器设备 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 2 5.1 PCR 仪。5.2 天平：感量 0.01 g。5
5、.3 电热恒温培养箱。5.4 离心机：转速12 000 r/min。5.5 浊度仪。5.6 卤素灯：照度25 000 勒克斯（Lux）。5.7 核酸电泳仪。5.8 凝胶成像系统。5.9 微量移液器：0.5 L10 L，10 L100 L，100 L1000 L，1 mL10 mL。5.10 涡旋仪。6 样品采集与制备 按GB/T 14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，整个过程避免人为污染。7 检验步骤 7.1 增菌 取25 g试样于225 mL缓冲蛋白胨水（4.2）中，充分混匀，36 1 培养18 h2 h进行预增菌，取0.1 mL预增菌液转移至10 mL氯化镁-孔雀绿增菌液
6、（4.3）中，42 1 培养24 h2 h。如果试样量不足25 g，试样质量与增菌液的体积比应为19。7.2 模板的制备 取 1 mL 增菌液至离心管中，12 000 r/min 离心 2 min，弃上清。加入 1 mL 灭菌水悬浮沉淀物，12 000 r/min 离心 2 min，弃上清，重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至 0.5 麦氏单位（MCF）。取 0.2 mL 菌悬液至离心管中，加入 2 L EMA 溶液（4.11）混匀，避光孵育 5 min。将离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光 2 min，然后水浴煮沸 10 min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却。涡旋混
7、匀裂解物，12 000 r/min 离心 2 min，收集上清液，作为 PCR 扩增的模板（模板制备可选用等效的商品化试剂盒）。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加沙门氏菌阳性标准菌株的样品作为阳性对照，用不含沙门氏菌的样品作为阴性对照。7.3 PCR 扩增 采用 50 L 反应体系：2Premix Taq 缓冲液（4.4）25 L，模板 5 L，浓度为 20 mol/L 的上、下游引物各 1 L，灭菌水 18 L。反应程序为：95 预变性 5 min；35 个循环：95 变性 30 s，59.8 退火 30 s，72 延伸 40 s；72 终延伸 5 min 后 4 保存。7.4 电泳
8、检测 PCR 扩增产物 称取1.5 g 琼脂糖（4.6）加入100 mL 1TAE电泳缓冲液（4.9）中，加热使其充分熔化，冷至65 左右，加入5 L溴化乙锭（4.12），充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，倒入凝胶制成约 5 mm厚的胶块。在电泳槽中加入适量1TAE缓冲液，使液面没过凝胶2 mm左右。取PCR扩增产物5 L8 L河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 3 与1 L 6上样缓冲液（4.10）混合后加入到上样孔内，设Marker 2000（4.7）对照。5 V/cm8 V/cm恒压下电泳20 min30 min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察
9、结果。8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 如果沙门氏菌阳性对照的PCR产物在284 bp处出现条带（参见附录B），同时阴性对照PCR产物于 284 bp处未出现条带，则检测结果成立；否则结果无效，应重新进行检测。8.2 阳性判定 样品的PCR产物电泳后在284 bp处出现条带，则为疑似阳性样品，此时需按GB/T 13091进行确证，最终结果以后者检测结果为准。8.3 阴性判定 样品的PCR产物电泳后在284 bp处未出现条带，判定25 g样品中未检出沙门氏菌。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 4 A A 附 录 A（规范性附录）培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水（B
10、PW）A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）9.0 g 水 1 000 mL A.1.2 制法 将以上成分混合加热溶解，冷却至25 左右调节至pH7.20.2，121 高压灭菌15 min。A.2 氯化镁-孔雀绿增菌液（RV）A.2.1 溶液A A.2.1.1 成分 蛋白胨 5.0 g 氯化钠 8.0 g 磷酸二氢钾 1.6 g 水 1 000 mL A.2.1.2 制法 将以上成分混合，加热至约70 溶解，冷却至25 左右调节至pH7.00.2。此溶液需当天使用。A.2.2 溶液B A.2.2.1 成分 氯化
11、镁（MgCl26 H2O）400 g 水 1 000 mL A.2.2.2 制法 将氯化镁溶于水中。A.2.3 溶液C A.2.3.1 成分 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 5 孔雀绿 0.4 g 水 100 mL A.2.3.2 制法 将孔雀绿溶于水中。溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中。A.2.4 完全培养基 A.2.4.1 成分 溶液A 1 000 mL 溶液B 100 mL 溶液C 10 mL A.2.4.2 制法 按上述比例配制，调节至pH5.2，分装每管10 mL。115 高压灭菌15 min。A.3 50TAE电泳缓冲液 A.3.1 成分 三羟甲基氨基甲烷（T
12、ris）242.0 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2 H2O）37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 灭菌水 942.9 mL A.3.2 制法 Tris和乙二胺四乙酸二钠溶于800 mL灭菌水，充分搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解；用1 mol/L NaOH调节至pH8.3，定容至1 L后，室温保存。使用时稀释50倍即为1TAE电泳缓冲液。A.4 6上样缓冲液 A.4.1 成分 溴酚蓝 0.5 g 二甲苯氰FF 0.5 g 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06 mL 甘油 360 mL 灭菌水 640 mL A.4.2 制法 0.5 mol/L EDTA（pH8.
13、0）溶于500 mL灭菌水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，定容至1 000 mL，分装后4 保存。A.5 叠氮溴化乙锭（EMA）河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 6 A.5.1 成分 叠氮溴化乙锭 5 mg 灭菌水 25 mL A.5.2 制法 5 mg叠氮溴化乙锭溶于5 mL灭菌水中，定容至25 mL，充分混匀，分装后-20 避光保存。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15882018 7 B B 附 录 B（资料性附录）沙门氏菌活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 沙门氏菌活菌EMA-PCR扩增电泳图参见图B.1。说明：MMarker 2000；1阴性对照；2阳性对照。图B.1 沙门氏菌活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 _ 河南省地方标准公共服务平台
