1、 ICS 65.020.20 B 20DB41 河南省地方标准 DB41/T 17332018 玉米中伏马毒素 B1测定 荧光偏振免疫分析法 2018-11-26 发布 2019-02-26 实施 河南省质量技术监督局 发 布 河南省地方标准公共服务平台河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17332018 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 原理.1 4 试剂.1 5 仪器.2 6 试样制备.2 7 分析步骤.2 7.1 提取.2 7.2 测定.2 8 计算.3 9 精密度.3 9.1 重复性.3 9.2 再现性.3 河南省地方标准公共服务平台DB41/T
2、17332018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省农业厅提出并归口。本标准起草单位：河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，河南省农产品质量安全检测中心，延津县农产品质量安全检测站。本标准主要起草人：刘冬梅、刘继红、王红旗、余新华、李淑芳、尹海燕、马莹、张军锋、张迪、曹成、徐晋豫。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17332018 1 玉米中伏马毒素 B1的测定 荧光偏振免疫分析法 1 范围 本标准规定了玉米伏马毒素B1的测定 荧光偏振免疫分析法。本标准适用于玉米中伏马毒素B1的测定。本标准的检测限为474.3 g/kg。2 规范性引用
3、文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理 试样中用磷酸盐缓冲溶液提取的伏马毒素B1与伏马毒素抗体形成复合物。在溶液中加入伏马毒素B1荧光标记物，与伏马毒素B1竞争伏马毒素抗体，形成伏马毒素B1荧光标记物与伏马毒素抗体的复合物产生荧光偏振。通过测定荧光偏振强度计算伏马毒素B1含量。4 试剂 试剂中的用水应符合 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。4.1 伏马毒素 B1荧光标记物（6，-（4,6-二氯三嗪基
4、）氨基荧光素标记的伏马毒素 B1，6-DTAF）（伏马毒素 B1荧光标记物的配置详见附录 A）。4.2 伏马毒素抗体（P2A5-3-F3）。4.3 -牛血清球蛋白（-BGG），99%，CAS 号 9007-83-4。4.4 甲醇(色谱纯)。4.5 乙腈(色谱纯)。4.6 伏马毒素 B1 标准品：晶体，纯度 95%；或经过国家认证授予标准物质证书的标准物质。4.7 10 mM 磷酸盐缓冲溶液（PBS 缓冲溶液）：其中含有 10 mM 磷酸钠，0.15 M 氯化钠，pH=7.2。4.8 0.1%-BGG 溶液：称取 0.05 g -BGG（4.3）溶解于 50 mL 10 mM PBS 缓冲溶液中
5、（4.7）。4.9 伏马毒素 B1荧光标记物储备液（100 g/mL）：取 1 mg 伏马毒素 B1荧光标记物（4.1），用甲醇（4.4）溶解，定容到 10 mL，储存与棕色瓶中，4 保存。4.10 伏马毒素荧光标记物使用液（0.4 g/mL）：取 8 L 伏马毒素 B1荧光标记物储备液（4.9），加入到 1992 L PBS 缓冲溶液（4.7），储存于棕色瓶中。现配现用。4.11 抗体溶液（4.0 g/mL）：抗体用 0.1%-BGG 溶液（4.8）稀释到浓度为 4.0 g/mL。4.12 1000 mg/L 伏马毒素 B1标准贮备液：称取 10 mg 伏马毒素 B1，用甲醇溶解，定容到 1
6、0 mL 容量瓶中。-20 冰箱中保存。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17332018 2 4.13 50 mg/L 伏马毒素 B1标准使用液：取 75 L 标准贮备液（4.12），加入到 1425 L PBS 缓冲溶液中，混匀。溶液浓度为 50 mg/L。现配现用。4.14 伏马毒素 B1标准工作液：分别准确吸取伏马毒素 B1标准使用液（4.13）0.002 mL、0.004 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL、4.00 mL 于 10 mL 的容量瓶中，用水定容，分别相当于10 g/L、20 g/L、100 g/L
7、、200 g/L、500 g/L、1000 g/L、2000 g/L、5000 g/L、20000 g/L 浓度标准工作液。4.15 定性中速滤纸。4.16 滤膜：0.22 m 有机滤膜。5 仪器 5.1 分析天平：感量0.0001 g、0.01 g；5.2 振荡器；5.3 涡旋混合器；5.4 荧光偏振测定仪：具有荧光偏振功能的激发波长 488 nm、发射波长 520 nm 的设备。6 试样制备 玉米：去除可见杂质，混匀，四分法缩分至约300 g，粉碎后全部通过孔径425 m的标准筛，取约 100 g储于食品塑料袋或玻璃广口瓶内，通风良好处常温存放，备用。7 分析步骤 7.1 提取 称取 20
8、 g 样品（准确至 0.01 g），置于 250 mL 具塞三角瓶中，加入 100 mL PBS 缓冲溶液（4.2.1），振荡器上震荡 1 h。用滤纸过滤，滤液采用 0.22 m 的滤膜过滤，滤液待测定用。7.2 测定 7.2.1 荧光偏振强度测定 在试管中依次加入900 L 磷酸盐缓冲溶液、100 L伏马毒素B1标准工作液或样品滤液、100 L抗体溶液，在涡旋混合器上混匀，放入荧光偏振测定仪中，测定。取出试管，加入100 L伏马毒素B1荧光标记物溶液，在涡旋混合器上，混匀，放入荧光偏振测定仪中，反应1 min，测定。记录测定得到的荧光偏振强度。7.2.2 标准曲线绘制 将配制好的伏马毒素B1
9、标准工作液（4.14）按照7.2.1测定方法测定不同浓度标准溶液的荧光偏振强度，以伏马毒素浓度（g/mL）荧光偏振强度（mP）作标准曲线。7.2.3 样品溶液的测定 按照7.2.1测定样品溶液的荧光偏振强度，根据标准曲线得到待测液中伏马毒素B1的浓度，样品中伏马毒素B1浓度应在标准工作曲线浓度范围内。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17332018 3 mVcX8 计算 试样中伏马毒素B1含量按式（1）计算：.（1）式中：X 试样中伏马毒素B1的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c 从标准曲线上得到的待测液中伏马毒素B1的质量浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V 试样中加入的提取
10、溶液体积，单位为毫升（mL）样；m 试样的质量，单位为克（g）；以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字。9 精密度 9.1 重复性 在重复性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差不得超过20%。9.2 再现性 在再现性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差不得超过的30%。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17332018 4 附 录 A(规范性附录)溶 液 配 制 伏马毒素B1荧光标记物（6，-（4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素标记的伏马毒素B1，6-DTAF）的配制 称取 10 mg 伏马毒素 B1，加入 0.1 mL 二甲基甲酰胺，再加入 0.
11、1 mL 0.1 M Na2CO3溶液，混匀。称取 1 mg 6-DTAF，加入 0.1 mL 二甲基甲酰胺，混匀。将 6-DTAF 溶液加入到伏马毒素溶液中，搅拌反应 8 h。将反应液移入加有 0.3 g 硅胶 60（粒径 20 m43 m，用二氯甲烷洗涤并干燥后使用）的小瓶中，用 0.4 mL 甲醇洗涤反应瓶 23 次，洗涤液并入小瓶中，用冷冻干燥机干燥过夜。荧光标记物的纯化采用填充柱净化，柱填料为硅胶 60（粒径 40 m63 m）。将约 10 g 填料溶解于二氯甲烷中，搅拌赶除气泡后，将溶液倾倒入填充柱中，静置待填料沉淀。样品用 10 mL 甲醇溶解，倾入柱中，分别用 50 mL 二氯甲烷和 50 mL 淋洗液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按 30:10:0.5 的比例混合）洗涤，最后用 60 mL 洗脱液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按 30:30:1 的比例混合）洗脱，收集洗脱液。40 水浴减压旋转蒸发近干，冷冻干燥机干燥过夜至荧光标记物为黄色粉状物。收集荧光标记物于瓶中，在-20 条件下保存。_ 河南省地方标准公共服务平台
