1、ICS 65.150B 51DB37山东省地方标准DB 37/T 23072013长蛸(种质)Species identification of Octopus minor2013-04-01 发布2013-05-01 实施山东省质量技术监督局发 布DB37/T 23072013I前言本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：马山集团有限公司、中国海洋大学。本标准主要起草人：郑小东、王培亮、李琪、李开锋、钱耀森、于瑞海、左仔荣、常忠岳、崔玉龙。DB37/T 230720131长蛸(种质)1范围本
2、标准规定了长蛸(Octopus minor(Sasaki,1920)的名称与分类、主要生物学性状、生长与繁殖、遗传特性及检测方法。本标准适用于长蛸种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.2养殖鱼类种质检验 第2部分:抽样方法GB/T 18654.13养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析3名称与分类3.1学名长蛸 Octopus minor(Sasaki,1920),Octopus variabilis(Sasaki,1
3、929)为其同物异名。3.2分类软体动物门（Mollusca），头足纲（Cephalopoda），八腕目（Octopoda），蛸科（Octopodidae），蛸属（Octopus）。4主要生物学性状4.1外部形态特征4.1.1外形胴体长卵形，胴长约为胴宽的2倍；体表光滑，具极细的色素色斑。长腕型，腕长约为胴长的6-7倍，各腕长度不等，第一对腕最长也最粗，其腕径约为其他腕径的两倍，腕式为1234，腕吸盘两行，基部为一行。雄性右侧第3腕茎化，甚短，仅约为左侧对应腕长度的二分之一；端器匙形，大而明显，约为全腕长度的六分之一。长蛸外部形态见图 1DB37/T 230720132图 1长蛸外部形态4.1
4、.2可数性状4.1.2.1腕式:12344.1.2.2齿式：3 1 34.2内部构造特征口球内具颚片和齿舌,齿舌的中央齿为五尖型，第一侧齿甚小，齿尖居中，第2侧齿基部边缘较平，齿尖略偏一侧，第3侧齿近似弯刀状,边缘齿外侧具有发达的缘板结构。雄性的阴茎略呈“6”字形，膨胀部卷成螺旋状，阴茎部较短。漏斗器W型。半鳃片数约910个。5生长与繁殖特性5.1生长生长迅速，半年全长可到200mm，第二年春季一般可达300mm400mm。5.2繁殖5.2.1一年性成熟，繁殖期间有短距离洄游。5.2.2产卵习性:性腺一年成熟一次，卵分批产出，卵子长茄型，长径 13 mm20 mm，短径 4 mm6 mm。5.
5、2.3繁殖水温:2026，最适水温 2224。5.2.4怀卵量:全长 540mm560mm 雌体，怀卵量 80140 个左右。6遗传特性6.1同工酶特性同工酶G3PD、AAT和SOD酶谱见图2图4DB37/T 230720133图 2长蛸同工酶 G3PD 酶谱图 3长蛸同工酶 AAT 酶谱图 4长蛸同工酶 SOD 酶谱6.2微卫星 DNA 分子检测特征微卫星DNA分子检测特征见图5、图6图 5引物 OM07 扩增长蛸肌肉组织 DNA 的凝胶电泳图谱图 6引物 OM09 扩增长蛸肌肉组织 DNA 的凝胶电泳图谱7检测方法7.1抽样方法参照GB/T 18654.2的规定执行。7.2同工酶分析7.2
6、.1凝胶缓冲液和电泳缓冲液的制备凝胶缓冲液见附录A，电泳缓冲液见附录B。DB37/T 2307201347.2.2分析样品的制备电泳前取0.3g样品放入1.5 ml离心管，加入等体积的提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷冻离心机中，在4、12000rpm的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用。7.2.3凝胶制备加淀粉30 g和制胶缓冲液254ml，在三角烧瓶内混匀，加热至沸腾，抽气，然后注入制胶模具中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。7.2.4电泳步骤用手术刀在凝胶距离边三分之一（约2.5 cm）处切开，用适当大小的滤纸片蘸取样品提取液放入切口中。上样完毕后，用滤纸搭盐桥，在4条
7、件下以40mA稳流进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7.2.5染色、固定电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3 mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒入染色盒后置于37 的恒温箱中进行染色。待酶显示足够的活性后，用10%的冰醋酸溶液终止反应。各种酶的染色液见附录C和附录D。7.2.6制干胶片取凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干，编号保存。7.2.7摄影、扫描用近焦镜头对凝胶及其谱带照相，或用扫描仪对干胶片电泳谱带进行扫描。7.2.8结果分析判定按GB/T 18654.13的规定执行。7.3微卫星 DNA 分析7.3.1基因组 DNA 的提取取长蛸肌肉0.1g，切碎至糜状，
8、加入500l CTAB裂解液，加入20l protein K酶，混合入1.5ml的离心管，55裂解过夜。7.3.2引物序列引物序列见表1表 1引物序列OM07-RCTACCTTCCCTAACCTCTCACTAOM07-FCTAGGAGTCTGAACAACGTCAAOM09-RGTTGCTAACGTCATGATAACAGCOM09-FCAAATCATCACCACCGACATC7.3.3PCR 反应体系DB37/T 23072013510l体系组分见表2表 210l 体系组分10buffer Mg2+1lDNTP(2mM)1lMgcl2(25mM)0.6lPrime(10M)1lPrime（10M
9、）1lr-Taq（5u/l）0.08lDNA模板(100ng/l)1lH2O4.32l7.3.4PCR 扩增条件94 预变性3 min,94变性1 min,Ta（OM07：64；OM09：56）1 min，退火30s,72延伸30s,38个循环，循环结束后72延伸5min。7.3.5聚丙烯凝胶酰胺电泳1000 ml的聚丙烯凝胶酰胺胶液配方:尿素(mw60.06)420 g，丙烯酰胺57 g，N,N-甲叉3 g，10TBE120ml，灭菌双蒸水定容至1000ml。PCR产物用6%的变性PAGE电泳，银染显色，冰醋酸固定，烘干以读取数据。DB37/T 230720136AA附录A（规范性附录）制胶
10、缓冲液的配制A.1CT-7.0 制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1.09 g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.2CT-8.0 制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷 1.21 g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.3CAPM-7.0 制胶缓冲液柠檬酸0.42 g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。DB37/T 230720137BB附录B（规范性附录）电泳缓冲液配制B.1CT-7.0 电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷 16.35 g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。B.2CT-8.0 电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷20g，用柠檬酸调至pH8.0，蒸馏水定容至1L。B
11、.3CAPM-7.0 电泳缓冲液柠檬酸8.4g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。DB37/T 230720138CC附录C（规范性附录）染色缓冲液配制C.10.2M Tris-HCl,pH8.0三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.0，蒸馏水稀释至1L。C.20.2M Tris-HCl,pH8.5三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.5，蒸馏水稀释至1L。C.30.1M磷酸缓冲液，pH7.0磷酸氢二钠17.91g和磷酸二氢钠8.05g，溶解定容至1L。DDB37/T 230720139DE附录D（资料性附录）几种常见同工酶的染色液配制方法同工酶英文
12、名和缩写试剂浓度用量甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseG3PDHa-Glycerolphosphate200 mgTris-HCl0.2mol/L pH8.525 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml苹果酸脱氢酶Malate dehydrogenateMDH苹果酸250 mgTris-HCl0.2mol/L pH9.525 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml乳酸脱氢酶Lactate dehydrogenaseLDH乳酸锂0.6 ml
13、Tris-HCl0.2mol/L pH8.525 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml超氧物歧化酶Superoxide dismutaseSOD氯化硝基四氮唑兰10 mg乙二胺四乙酸二钠盐100 mgTris-HCl0.2 mol/L pH9.525 ml乙醇2.5 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml蒸馏水20 ml酯酶EsteraseEST丙酮1 ml固牢 RR 盐32 mg磷酸缓冲液0.1mol/L pH7.020 ml.乙醇2 ml-萘乙酸1%20 ml苹果酸酶Malic enzymeME苹果酸250 mgTris-HCl0.2mol/L pH8.525 mlMgCl21 mol/L1 mlNADP 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 mlTris-HCl0.2mol/L pH8.025 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml_
