1、B 4 1省D B1 3方标准卜JJ河地D B1 3/T 4 9 2-2 0 0 4猪免疫技术规程2 0 0 4-0 3-1 0 发布2 0 0 4-0 3-1 0 实施河 北 省 质 量 技 术 监 督 局发布DB 1 3/I 4 9 2-2 0 0 4 吕本标准的附录A,附录B 为规范性附录。本标准由河北省畜牧局提出。本标准起草单位:河北省畜牧兽医站.本标准主要起草人:郑文波、李凯伦、白 玉坤、王玉清、路广计、李志民、陶茂晖、王振来、李DH 1 3/I 4 9 2-2 0 0 4猪免疫技术规程1 范围 本标准规定了猪主要传染病的免疫程序、免疫操作方法、免疫操作要求和免疫效果监测.本标准适用
2、于河北省境内各类养猪场对生猪的免疫。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准.2.1 疫苗 V a c c i n e 由 特定细菌、病毒、立克次氏 体、螺旋体、支原体等病原微生物以及寄生虫制成的，能刺激机体产生相应抗病能力的制品.2.2 免疫接种 V a c c i n a t i n g 将疫苗注入动物体内(肌肉、皮下、粘膜)使动物对相应疫病产生特异性抵抗能力的 方法。2.3 免疫抗体监测 A n t i b o d y n a n i t o r i n g 动物进行免疫接种后.在一定时期内，通过血清学或其他方法，对动物的免疫接种效果进行定性或定量测量。3 免应程序3.1 仔猪 仔猪免
3、疫按下列程序进行:a)达到1 5 日 龄时，注射猪喘气病灭活苗(弱毒苗):b)达到.日 龄时，注射猪瘟弱毒细胞苗:c)达到加日 龄时.注射 仔猪副 伤寒 弱毒 苗和 猪喘 气病灭 活 苗(弱 毒苗):d)达到4 5日 龄时，注射口 蹄疫灭活苗:e)达到6 0日 龄时.注射猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗.3.2 后备母猪 后备母猪按下列程序进行:a)配种前1.5 个月.注射猪乙 型脑炎弱毒苗;b)配种前1 个月.注射猪细小病毒弱毒疫苗;c)达到7 月龄时，注射口 蹄疫灭活苗:d)达到5 月龄至7 月龄时，注射猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗.33 后备公猪 后备公猪按下列程序进行:a)达到5 月龄至配种前
4、半个月，注射猪细小病毒弱毒疫苗和猪乙型脑炎弱毒苗:b)达到5 月龄 至7 月 龄，注 射猪瘟、猪丹毒、猪 肺 疫三联 苗。34 可繁母猪 可繁母猪按下列程序进行:a)每年5 月份和1 0 月份，各注射一次猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗:D H1 3 厅4 9 2-2 0 0 4 b)每年4 月份和1 0 月份，各注射一次猪喘气病灭活苗(弱毒苗):c)每年5 月份和1 0 月 份，各注射一次口 蹄疫灭活苗;d)每 年1 1 月 份 或1 2 月 份。注 射猪 传染 性胃 肠炎 疫 苗。e)配种前1 个月，注射猪乙型脑炎弱毒苗;0 产前4 0 天.注射猪伪狂犬病灭活苗;d)产前4 0 天和1 5 天，
5、各注射一次仔猪大肠杆菌三价灭活苗(弱毒苗);幼 产前3 0 天和1 5 大，红 痢 疫区 可繁 母 猪各 注射 一次 仔 猪红 痢疫 苗。3.5 种公猪 种公猪可按下列程序进行:e)每年5 月份和1 0 月份，各注射一次猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗;b)每年4 月份和1 0 月份，各注射一次 猪喘气病灭活苗(弱毒苗)和猪伪狂犬病灭活苗:c)每年5 月份和1 0 月份，各注射一次口 蹄疫灭活苗:d)每年1 1 月 份或1 2 月 份.注射 猪 传染 性胃 肠炎 疫 苗。3.6 商品猪 商品猪可按下列程序进行:a)达到1 5 日 龄时，注射猪喘气病灭活苗(弱毒苗);b)达到加 日 龄时.注射猪瘟弱毒
6、细胞苗;c)达到3 0 日 龄时，注射猪喘气病灭活苗(弱毒苗):d)达 到3 5 日 龄时，注射 仔 猪副 伤寒 弱毒 苗:e)达到4 5 日 龄时。注射口 蹄疫灭活苗;乃 达到T日 龄时.注射猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗.4 免疫操作方法4.1 保定 对猪进行确实保定。4.2 选定注射部位 颈部耳后2 c m 9 c m处或臀部肌肉 丰富部位.4.3 注射部位消毒 先用消水将注射部位擦洗，把污物擦洗掉.再用5%的碘配和 s%的酒精，对注射部位由内 及外划圆消毒。4.4 疫苗的稀释 对需要稀释的疫苗，先将疫苗的瓶口 用7 5%的酒精消毒。再按照使用说明书要求的 配比 用稀释液或生理盐水进行稀释。
7、4.5 免疫接种 用消毒好的注射器(或连续注射器)将配备好的疫苗.按照疫苗使用说明书要求的剂量注入猪体适宜部位。5 免疫操作要求5.1 猪在健康的情况下才能免疫。5.2 在注射弱毒病毒疫苗时.不得使用抗病毒类药物;在注射弱毒菌苗时。不得使用抗菌素类药物。5.3 免疫前，对免疫注射部位用消1 k 酒精和碘可进行消毒.5.4 同一批次的猪要同时进行免疫。DH 1 3/I 4 9 2-2 0 0 46 免疫效果监测6.1 监测时间 免疫后1 5 d 3 0 d 进行.8.2 采样比 例 种公猪1 0 0%，母猪FY Y !，仔猪5%，商品猪5%06.3 待检样品制备 采血5 毫升.分离血清备检。6.
8、4 检测方法B.4.1 猪瘟 正向间接血凝试验或单抗酶联免疫吸附试验(E L I S A)。单抗E L I S A试验方法按附录A的规定进行。6.4.2 口蹄疫 正向间接血凝试验，试验方法按附录B的规定进行。DH1 3/I 4 9 2-2 0 0 4 附录A (规范性附录)猪瘟单克隆杭体E L I S A 试验方法A.1 方法提要 本方法主要用于检测猪瘟免疫是否合格.是否为猪瘟强毒感染。以便制定正确的免疫程序，保障猪群免遭猪瘟强毒的感染。所用抗原包括猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪监强毒单抗纯化酶联抗原，分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用.如果在猪瘟弱毒酶联板上
9、光密度(O D)大于或等于0.2 且在强毒酶联板上光密 度(O D)小于0.5.说明猪只经弱毒疫苗免疫效果好且无猪瘟强毒感染。A.2 试剂 a)碳 酸 钠、碳 酸 氢 钠、氯 化 钠、磷 酸 二 氢 钾、T i :._ 钠(无 水)、磷 酸 氢 二 钠(1 2 H Z 0),氯化钾、柠檬酸、邻苯二胺(分析纯):b)吐 温-2 0,9 8%浓硫酸、3 0%l 氧水(分析纯)，蒸馏水(双蒸)，小牛血 清.人.3 设备和仪器 a)酶标仪，4 9 2 n m波 光片:b)固相%孔平底聚苯乙 烯专用板;c)恒温培养箱;d)震荡器;e)移液器:乃 天 平(感量O.O O I g);目 1 0 0 0 m
10、L 容量瓶若干;h)1.O m L,S.O m L,f O.O m L 移液管若干;i)1 0 0 m L,2 5 0 m L 磨门 锥形瓶若千。A.4 步骤A.4.1 试液的配制A.4.1.1 包被液 称取碳酸钠1.5 9 g 和碳酸氢钠2.9 3 g 放入1 0 0 0 m L 容 i-瓶中。加蒸馏水完全溶解后定容。加入适量3 1 1 氢氧化钠溶液调P H为9.6,.4.1.2 洗涤液 a)称 取氛 化 钠8.0 ,磷酸 三 氢 钾0.2 g,磷 酸氢 二 钠(无 水)2.1 3 g,氯 化 钾0.2 g 放 入1 0 0 0 m L容量瓶中，加蒸馏水完全溶解后定容，加入适量3 M 氢氧化
11、钠溶液调P H为7.4,b)量取上述溶液1 0 0 0 m 1.放入1 0 0 0 m L 烧杯中，加入吐7f -2 0 0 _S m L.搅扑均匀。A.4.1.3 稀释液 量取洗涤液1 0 0 m L 放入2 O m l 磨 I 锥形瓶中，加入小牛血清S m L，充分摇匀.A.4.1.4 底物液 a)称取柠檬酸2 1.0 g 放入 1 0 0 0 m L齐量瓶中.加蒸馏水完全溶解后定容。即成0.1 M 柠橡酸溶液。DB1 3(1 4 9-2 0 0 4 b)称 取磷 酸 氢二钠(1 2 H Z 0)7 1.6 g 放入1 0 0 0 m L 容量瓶中，加燕 馏 水完 全溶 解后定 容，即 成
12、。.u l 磷酸氢二钠溶液.c)量取0.1 M 柠檬酸溶液2 4.3 m L 和0.2 M 磷酸氢二钠溶液2 5.7 m L 放入1 O O m L 磨口 锥形瓶中，摇匀.d)取 上述 混合 液2 0 m L 放 入1 0 0 m L 磨口 锥形 瓶中，加 入邻苯 二 胺2 0 m g 摇匀。临 用前 加 3 0%双氧7 5 L eA.4 _ 1.5 终止液 量取5 0 0 m L蒸馏水放入 1 0 0 0 m L烧杯中，缓慢加入7 6 m L浓硫酸，搅拌均匀。人.4.2 包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作i 4:倍稀释，以1 0 0 匹分别加入做好标记的酶联板孔中
13、，置湿盒于4 过夜.A.4.3 去孔内 液体.用洗涤液冲洗板3 次，每次间隔3 m i n -5 m in，拍干。A.4.4 用稀释液将待检血清作S I:倍稀释，每孔加 1 0 0 泌.同时，将猪瘟阳性、阴性血清以1 0 0 倍稀释作对照，3 7 培育1.S h 2 h,A.4.5 重复A.4.3,A.4.6 用稀释液将兔抗猪 I g G辣根过氧化物酶结合物作 1 0 0倍稀释。每孔加入 1 0 即L.3 7 培育1.5 h -t h eA.4.7 重复A.4.3 oA.4.B 征 孔加入 底物 液 1 0 0 匹.室 沮下 观察显 色 反 应(当阴 性 对照 孔略 微显 色，立即终 止反 应
14、，并以阴性孔作空白调零).A.4.9 每孔加 入终 止液5 0 匹，于酶 标 仪上 测定4 9 0 m n 波长的 光密 度(O D)e.5 判定标准 在猪瘟弱毒酶联板上:a)O D 0.2，为 猪瘟弱 毒抗 体阳 性;b)O D 0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性.在猪瘟张毒酶联板上:a)O D 0.5.为猪瘟张毒抗体阳性;b)O D 0.5，为猪瘟强毒抗体阴性.DH 1 3/I 4 9 2-2 0 0 4 附录B (规范性附录)正向间接血凝试验方法B.1 方法提要 本方法主要用于检测口 蹄疫免疫效价，以 便制定正确的免疫程序，保障猪群免遭口 蹄疫强毒的感染.接种口 蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1
15、:1 2 8 为免疫合格。B.2 试剂 稀释液、口 蹄疫止向血凝抗原、口 蹄疫阴性对照血消、口 蹄疫对照阳性血清。B.3 设备和仪器 a)V型血凝板;b)移液器;c)微量 震荡 器;d)恒温培养箱。B.4 操作步密B.4.1 加稀释液 在血凝板上L 排一6 排的1 孔 9 孔;第7 排的1 孔一 4 孔和第6 孔;第8 排的1 孔1 2 孔各加稀释液5 0 u l oB.4.2 稀释侍检血清 取1 号待检血消S O I L 加入第1 排第1 孔，并将塑咀插入孔底，右手姆指轻压弹簧1 次-2 次混匀(避 免产 生 过多的 气泡)，从该 孔 取出5 0 匹移入 第2 孔，泪 匀后 取出5:匹移 入
16、第3 孔 直至 第9 孔混匀后取出S O I L 丢弃.此时第1 排!孔9 孔待检血清的稀释度(稀释倍数)依次为:1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:1 6(4)1 _3 2(5)1:6 4(6)1:1 2 8(7)1:2 5 6(B)1:5 1 2(9),取2 号待检血清加入第2 排，取3 号待检血清加入第3 排 均按上述方法稀释，注意每取一份血清时，必须更换塑咀一个.8.4.3 摇释阴性对照血清 在 血凝 板 上的 第7 排 第!孔 加阴 性 血 清5 0 匹，对倍 稀 释至 第4 孔，混 匀后从 该 孔 取出5 0 匹丢弃。此时阴性血清稀释倍数依次为1:z(1)1:4(2)1.8 C 3)1:1 6(4)。第6 孔为稀释液对照。B.4.4 希释阳性对照血清 在血 凝 板上的 第8 排第l 孔 加阳 性血 消S O p L。对 倍 稀释 至第1 2 孔，混 匀 后从 该孔 取出S O I L 丢弃。此时阳性血清稀释倍数依次为1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:1 6(4)1:3 2(5)1:6 4(6)1:1 2 8(7)1:2 5 6(8)1:5 1 2(9),8.4.5
