1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 23252014 猪传染性胃肠炎病毒 RT-PCR 检测方法 Method of RT-PCR for the detection of transmissible gastroenteritis virus 2014-07-05 发布 2014-09-05 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 23252014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究
2、院。本标准主要起草人：于学武、谷志大、赵晓彤、陈瑶、赵凤菊、赵培、闫明媚、兰德松、关乃鹏、关淼、孙世宇、华泽军、刁贺军、王志国 DB21/T 23252014 1 猪传染性胃肠炎病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）RT-PCR 检测方法的技术要求。本标准适用于猪传染性胃肠炎的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中 TGEV核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全级（BSL-2）以上的实验室进行。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的
3、引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）bp：碱基对（base pair）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase c
4、hain reaction）Taq酶：HS Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒（avian myeloblastosis virus）PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris acetate-EDTA buffer）4 原理 TGEV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链D
5、NA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5 仪器和器材 DB21/T 23252014 2 本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000 g以上）、冰箱（28，-20和-70三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5 mL离心管、0.2 mL离心管、微量移液器和吸头。6 试剂和材料 6.1 Trizol：RNA 抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于 48 保存。6.2 氯仿：4 预冷。6.3 异丙醇：4 预冷。6.4 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC 水配制，-2
6、0 预冷。6.5 DEPC 水：去离子水中加入 0.1%DEPC，37作用 1 h，121（2），高压灭菌 15 min。6.6 RNA 酶抑制剂（40 U/L）。6.7 DNA 聚合酶：HS Taq DNA 聚合酶（5 U/L）。6.8 dNTP（10 mmol/L）。6.9 用于 RT-PCR 反应的引物浓度为 20 mol/L，其序列如下：上游引物 F：5-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3 下游引物 R：5-CAACCCAGACAACTCCATCTA-3 6.10 反转录酶：AMV 反转录酶（5 U/L）。6.11 反转录引物：Oligo dT-Adaptor Pri
7、mer（2.5 mol/L）。6.12 阴性对照：DEPC 水。6.13 阳性对照：TGEV 细胞培养物。6.14 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L pH7.2）。6.15 TAE：三羟甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓冲液。6.16 溴化乙锭。6.17 DL2000 DNA Marker。注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。7 操作步骤 7.1 样品的采集、前处理、存放和运送 7.1.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。DB21/T 23252014 3 7.1.2 采样工具 药匙、15 mL 离心管和 1.5 mL
8、离心管经 121（2）高压灭菌 15 min；剪刀、镊子经 160 干热灭菌 2 h。7.1.3 肠内容物的采集与前处理 采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入 15 mL 灭菌离心管中，按 1：5 倍体积加入 PBS（见附录 A），混匀，3000 rpm离心 20 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中编号备用，待检。7.1.4 粪便的采集与前处理 用药匙采取发病猪新鲜粪便，装入 15 mL 灭菌离心管中，按 1：5 倍体积加入 PBS（见附录 A），混匀，3000 rpm离心 20 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中编号备用，待检。7.1.5 细胞培养物 细胞培养物冻融 3 次
9、，转入 1.5 mL 离心管中编号备用。7.1.6 存放与运送 采集或处理的样品在 28 条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70 冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过 3 次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 68 h 之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7.2 RT-PCR 检测 7.2.1 RNA 提取 在核酸提取室进行。7.2.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2 每管加入 750 L Trizol，分别加入被检样品
10、、阳性对照和阴性对照各 250 L，颠倒 10 次混匀，室温静置 5 min；再加入 250 L 氯仿，混匀器上振荡混匀 15 s（也可以用手反复颠倒混匀）。4 12000g离心 15 min。7.2.1.3 取与 7.1.1 中相同数量灭菌的 1.5 mL 离心管，加入 500 L 异丙醇(4 预冷)。取 7.1.2 中离心后的上清液约 500 L 转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置 15 min。7.2.1.4 4 12000 g 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 1 mL 75%乙醇。7.2.1.5 4 12000 g 离心 10 min，弃上清，倒置于吸水纸
11、上，沾干液体。7.2.1.6 4000 g 离心 10 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥 310 min。7.2.1.7 加入 18 L 经 DEPC 处理的水和 2 L RNA 酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的 RNA，冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增；于-70 冰箱长期保存。7.2.2 反转录 7.2.2.1 反转录体系 DB21/T 23252014 4 建立 10 L 的反应体系，按下列组分加入离心管中：MgCl2 2 L 10RT Buffer 1 L RNase Free dH2O 2.75 L dNTP Mixture(各 10m
12、M)1 L RNase Inhibitor 0.25 L AMV Reverse Transcriptase*1 0.5 L Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 L 实验样品 RNA 2 L 7.2.2.2 反转录条件 42 1 h；95 5 min；5 5 min。7.2.3 PCR 7.2.3.1 PCR 反应体系 建立 50 L 的反应体系，按下列组分加入 PCR 专用离心管中：5PCR Buffer 10 L 灭菌蒸馏水 27.75 L HS Taq DNA 聚合酶 0.25 L 上游特异性 PCR 引物 1 L 下游特异性 PCR 引物 1 L 反转录产物 10
13、L 7.2.3.2 PCR 反应条件 94 预变性 3 min；94 变性 30 s，53 退火 30 s，72 延伸 50 s，35 个循环；72 终延伸 10 min。7.2.3.3 电泳 将 PCR 扩增产物 6L 与 1L 上样缓冲液混合，点样于 1.2%琼脂糖凝胶（见附录 A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入 DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为 1TAE，以 5 V/cm电压电泳 25 min。8 结果判定 紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在 276 bp 扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现 276 bp
14、 扩增条带为 TGEV 核酸阳性，未出现 276 bp 扩增条带的样品判为 TGEV 核酸阴性。DB21/T 23252014 5 图注：MDL2000 DNA Marker，N阴性对照，P阳性对照，1、3、5阳性样品，2、4阴性样品 图1 PCR扩增产物电泳检测结果 DB21/T 23252014 6 附 录 A（规范性附录）A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1.1 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H20）71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1000mL，混匀。A.1.2 0.2 mol/L 磷酸二
15、氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H20）31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.1.3 量取 0.2 moL/L 磷酸氢二钠溶液 360 mL，0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 140 mL，称取氯化钠 38 g，用无离子水溶解稀释至 5000 mL，4保存。A.2 电泳缓冲液（50 倍）A.2.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.2.2 TAE（三羟甲基氨基甲烷一乙酸）电泳缓冲液（50 倍）羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)100 mL 灭菌双蒸水 加至 1000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.3 1.2%琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级）1.2 g TAE 电泳缓冲液（50 倍）2 mL 灭菌双蒸水 98 mL 微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液 10 L。A 录 C（规范性附 _
