1、 1 ICS 11.020 C 05 备案号：58323-2018 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 396.42017 代替 DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 4 部分：皮肤刺激性试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 4:Skin irritation test 2017-11-10 发布 2017-12-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用
2、 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 前 言 DB22/T 396-2017保健用品毒理学评价程序与检验方法拟分为如下部分：第 1 部分：评价程序；第 2 部分：急性经皮毒性试验；第 3 部分：长期经皮毒性试验；第 4 部分：皮肤刺激性试验；第 5 部分：皮肤变态反应试验；第 6 部分：细菌回复突变试验；第 7 部分：啮齿动物微核试验；第 8 部分：小鼠精子畸形试验；第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验；第 10 部分：致畸试验；第 11 部
3、分：致癌试验；第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。本标准为 DB22/T 396-2017 的第 4 部分。本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本部分代替DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法，与DB22/T 396-2014相比，结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术内容变化如下：增加了警示；增加了范围；增加了仪器；增加了附录 A；增加了附录 B。本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本部分主要起草人：孟令仪、张晶莹、宋昕恬、孙兰、吴晓刚、隋自洁、高峰。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：DB22/T
4、396-2004；DB22/T 396-2014。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 保健用品毒理学评价程序和检验方法 第 4 部分：皮肤刺激性试验 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了保健用品毒理学皮肤刺激性试验评价程序。本标准适用于
5、保健用品毒理学皮肤刺激性试验检验方法。2 皮肤刺激性试验检验方法 2.1 材料 2.1.1 动物 多种哺乳动物均可被选为实验动物，首选白色家兔。应使用成年、健康、皮肤无损伤的动物，雌性和雄性均可，但雌性动物应是未孕和未曾产仔的。实验动物至少要用4只。实验动物应单笼饲养，试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d时间。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。2.1.2 受试物 液态受试物一般不需稀释，可直接使用原液，膏状受试物，可直接使用原膏霜。若受试物为固体，应将其研磨成细粉状，并用水或其它无刺激性溶剂充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触。使用其它溶剂，应考虑到该
6、溶剂对受试动物皮肤刺激性的影响。受试物为强酸或强碱（pH值2或11.5），可以不再进行皮肤刺激试验。此外，若已知受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD 50小于200 mg/kg BW或在急性经皮毒性试验中受试物剂量为5000 mg/kg BW仍未出现皮肤刺激作用也无需进行急性皮肤刺激性试验，LD 50计算见附录B。2.1.3 仪器 2.1.3.1 体重秤,精确到 0.1 Kg；2.1.3.2 放大镜。2.2 试验方法 2.2.1 皮肤急性刺激试验（一次皮肤涂抹试验）皮肤急性刺激试验步骤：a)试验前约 24 h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约 3 cm3 cm；b
7、)取受试物约 0.5 mL（g）直接涂在皮肤上，然后用二层纱布（2.5 cm2.5 cm）和一层硫酸纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作对照。采用封闭试验，敷用时间本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 2 为 4 h。可根据人的实际使用和产品类型，延长或缩短敷用时间。对用后冲洗的产品，仅采用 2 h敷用试验。实验结束后用温水或无刺激性溶剂清除残留受试物。如怀疑受试物可能引起严重刺激或腐蚀作用，可采取分段试验，将三个涂有受试物的纱布块同时或先后敷贴在一只家兔背部脱毛
8、区皮肤上，分别于涂敷后 3 min、60 min 和 4 h 取下一块纱布，皮肤涂敷部位在任一时间点出现腐蚀作用即可停止试验；c)于清除受试物后的 1 h、24 h、48 h 和 72 h 观察涂抹部位皮肤反应，按表 1 进行皮肤反应评分，以受试物积分的平均值进行综合评价，根据 24 h、48 h 和 72 h 各观察时间点最高积分均值，按表 2 判定皮肤刺激强度；d)观察时间的确定应足以观察到可逆或不可逆刺激作用的全过程，一般不超过 14 h。表 1 皮肤刺激反应评分 刺激反应 分值 红斑：无红斑 0 勉强可见 1 中度红斑 2 严重红斑 3 紫红色红斑并有焦痂形成 4 水肿：无水肿 0 勉
9、强可见 1 轻度可见(边缘高出周围皮肤)2 反肤隆起约 1mm 轮廓清楚 3 水肿隆起 1mm 以上并范围扩大 4 最高总分值 8 表 2 皮肤刺激强度分级 刺激强度 平均分值 无刺激性 0.00.49 轻度刺激性 0.52.99 中度刺激性 3.05.99 强刺激性 6.08.00 2.2.2 皮肤慢性刺激试验(多次皮肤涂抹试验)皮肤慢性刺激试验步骤：a)试验前将实验动物背部脊柱两侧皮肤的毛剪掉，去毛范围各为 3 cm3 cm，涂抹面积 2.5 cm2.5 cm；本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 39
10、6.42017 b)取受试物约 0.5 mL(g)涂抹在一侧皮肤上，当受试物物无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹 1 次，连续涂抹 14 d。从第二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。1 h 后观察结果，按表 1 评分，对照区和试验区同样处理。2.3 结果评价 按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表 2 判定皮肤刺激强度。nkK1.(1)式中：k每天每只动物平均积分；1k红斑和水肿积分；n受试动物数。A 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 4
11、附 录 A（规范性附录）实验动物体表面积估算方法 A.1 兔 32mks.(A.1)式中：s体表面积，cm2；k常数，一般成年家兔为 10；m动物体重，g。例：体重 2 kg 成年家兔体表面积：32200010s 21588S2008.32008.213010.3667.012000lg3210lglgcmS查反对数表：A.2 豚鼠 32mks.(A.2)式中：s体表面积，cm2；k常数，26.9k；m动物体重，g。例:体重 438 g 豚鼠的体表面积：2534S7276.27610.19666.08805.0329666.0438lg3226.9lglgcmS查反对数表：A.3 大鼠、小鼠
12、本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 32mks.(A.3)式中：s体表面积，cm2；k常数，0913.0k；m动物体重，g。例：体重 200 g 大鼠的体表面积：322.00913.0s 2123.3S1945.25340.19605.23010.1329605.22.0lg320913.0lglgcmS查反对数表：本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 6 A B 附 录 B（规
13、范性附录）LD50计算方法 B.1 霍恩氏法（Horn）一般各剂量组使用5只动物，常用的剂量系列有两排：100.1064.415.201.1t 106.310.1016.30.1t 3,2,1,0t 前排系列的剂量间距较后排系列为小，结果较为精确，所以一般常选用之。预备试验：通常采用10 mg/kg，100 mg/kg和1000 mg/kg的剂量，各剂量使用2只3只动物。根据24 h内动物死亡情况，估计LD50的可能范围，以确定正式试验所用的剂量。正式试验:按预试所确定大概的致死剂量范围选用一组适宜的剂量系列，根据四个剂量组的动物死亡数，从Horn氏法LD50计算用表中，可求出LD50值及其可
14、信限。此法的优点是简单易行，使用动物少，可用来初步了解受试物的毒性强弱。缺点是所得LD50的可信限范围较宽，不够精确。B.2 机率单位对数图解法 先把剂量的对数值和相应反应的机率单位用点代表画在图上（用机率对数图纸直接把剂量和死亡百分数画在图上）。画线时应照顾所有图上各点，使点散布在线的上下，并使线上点的距离和线下点的距离能相互抵消，特别注意在死亡率15%到85%间的点，机率单位4与6之间的点，尽量使线接近这部分的点。当直线划定后，由图直线上50%死亡率(机率单位为5)的相应剂量对数值，就是半数致死量（LD50）的对数值，经反对数变换后即得LD50的剂量。半数致死量（LD50）可信限估计：先求
15、50LD的标准差S按式（A.1）：1212yyxxs.(B.1)式中：2x、1x相当于62y、41y（概率单位）时相应的X轴上的对数剂量。估计50logLD的标准误按式(B.2)本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 1215022lognsnsLD或.(B.2)式中：1n反应百分率为16%84%之间所用试验动物数。半数致死量对数值的95%可信限为sLD96.1log50 该法要求：一般每剂量组使用不少于10只动物。但各组动物数不一定均等。此法不要求剂量组呈等比关系，但等比可使各点距离相等
16、，利于作图。本法优点是，不需烦琐的计算。B.3 寇氏法(Karbermettod)该法是一种计算简便，易于理解，而且计算结果比较准确的一种方法。依本方法设计时，剂量范围可宽些，剂量组必须多，但组间对数剂量差(组距)可以小些。预备试验：一般应求得动物全死(或90%以上死亡的剂量)和动物不死亡（或10%以下死亡的剂量），分别作为正式试验的最高与最低剂量。正式试验：一般设5 个10 个剂量组。将上述最高、最低剂量均换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差，按所需要的组数，分为几个对数等距（也可以不等距）的剂量组。试验结果的计算和统计：a)列出试验数据及其计算表：包括各组剂量（mg/kg）、对数剂量（X）、动物数（n）、动物死亡(r)、动物死亡百分比（P，以小数表示）以及统计公式中要求的其他计算数据项目；LD50的计算公式：根据试验条件及试验结果，可分别选用下列三个公式中的一个，求出 LD50；1)按本试验设计得出的任何结果，均可用式(A.3)计算：iiiippxxLD115021log.(B.3)式中：ix与1ix及ip与1ip分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比 2)按本试验设计
