1、 ICS 07.100.30 C 53 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 15392011 禽蛋中沙门氏菌的检测-荧光 PCR 法 Testing for Salmonella in Poultry eggs Qualtative polymerase chain reaction(PCR)method 2011-11-15 发布 2011-12-15 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 15392011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心提出。本标准起草单位：国家农副加
2、工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。本标准主要起草人：陈戈、张波、汪永信、安虹、刘娟娟、程潇。DB34/T 15392011 1 禽蛋中沙门氏菌的检测-荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了禽蛋中沙门氏菌的荧光 PCR 检测方法。本标准适用于禽蛋及禽蛋制品中沙门氏菌的快速检测。本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/
3、T 4789.19 食品卫生微生物学检验 蛋与蛋制品检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 CT 值 PCR 扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数。4 方法原理 本方法是基于 TaqMan 实时荧光PCR技术，选取沙门氏菌种属特异性的 invA 基因序列设计引物和两端有荧光基团标记的寡核苷酸探针。PCR 每进行一次循环，PCR 产物的量与荧光信号的强度呈对应关系，当荧光信号超过所设定的阈值时，荧光信号可被检测出来。通过观察实时 PCR 扩增曲线，对样品中的沙门氏菌进行快速检测
4、。5 设备和材料 5.1 实时荧光 PCR 仪。5.2 离心机。5.3 微量移液器和灭菌吸头（10 L、100 L、200 L、1000 L）。5.4 恒温培养箱。5.5 恒温水浴锅。DB34/T 15392011 2 5.6 天平：感量为 0.1 g。5.7 均质器或乳钵。5.8 灭菌三角烧瓶(500 mL、250 mL)。5.9 灭菌吸管（10 mL、1 mL）。5.10 灭菌平皿（90 mm15 mm）。5.11 灭菌试管（内径 16 mm，长 160 mm）。5.12 接种棒、镍铬丝。5.13 试管架、试管篓。6 试剂 6.1 除另有规定外，水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格
5、，且为灭菌双蒸水，试剂为分析纯或生化试剂。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。6.2 Taq DNA 聚合酶。6.3 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。6.4 DNA 提取试剂：DNA 提取液（5chelex100，10 mmol/LTris-HCl、1 mmol/LEDTA）加入 100 mL灭菌蒸馏水中，摇匀；也可使用商业化的 DNA 提取试剂盒。6.5 10PCR 缓冲液：200 mmol/Ltris-HCl(Ph8.4),200 mmol/L 氯化钾（KCL），15 mmol/L 氯化镁（MgCl2）。6.6 引物和探针：正向引物：5-TGCGGTACTGTTAA
6、TTACCACGC-3；反向引物：5-GGCATCGGCTTCAATCAAGA-3；探针序列：5-TGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTC-3 其中探针的 5端标记FAM、3端标记 TAMRA。6.7 培养基：缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）。7 检测步骤 7.1 样品的制备、增菌培养 7.1.1 禽蛋制品应经过前增菌，以无菌操作的方式称取 25 g 样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以 8000 r/min-10000 r/min 均质 1 min2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，
7、用拍击式均质器拍打 1 min2 min。用 1 mol/L 无菌氢氧化钠或盐酸调 pH 至 6.80.2。无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 361 培养 818 h(干蛋品培养 1824 h)。轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 421 培养 18 24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 361 培养 1824 h。7.1.2 新鲜禽蛋不必经过前增菌，直接进行选择性增菌，以无菌操作的方式称取 25 g 样品放入盛有225 mL 灭菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min
8、-10000 r/min 均质 1 min2 min，或置于盛有25 mL 灭菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min-2 min。用 1 mol/L 无菌氢氧化钠或盐酸调 pH 至 6.80.2。以无菌操作的方式移取 1 mL 检样均液接种于 10 mL TTB 内，于 421培养 1824 h；另取 1 mL，接种于 10 mL SC 内，于 361 培养 1824 h。7.2 模板 DNA 的制备 DB34/T 15392011 3 取培养后的增菌液 1 mL，加到 1.5 mL 无菌离心管中,8000 r/min 离心 5 min，吸弃上清；加入50 L DNA 提取液
9、（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴 5 min，12000 r/min 离心 5 min，取上清保存于 20 备用以待检测。也可使用商业化的 DNA 提取试剂盒并按其说明制备模板 DNA。7.3 实时荧光 PCR 检测 7.3.1 反应体系体积为 25 L:10PCR 缓冲液 2.5 L、引物对（10 mol/L）各 1 L、dNTP（10 mmol/L）1 L、荧光探针（5 mol/L）1 L、Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.5 L、模板 DNA 4 L，加水至 25 L。7.3.2 反应条件:375 min，95 预变性 5 min，95 变性 15 s，55 退
10、火延伸 40 s，同时收集 FAM 荧光，进行 40 个循环，4 保存反应产物（PCR 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整）。7.3.3 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子 DNA 或阳性菌侏DNA，阴性对照为无菌水。8 结果及判断 8.1 质控标准 a)阴性对照：无扩增曲线，Ct40；b)阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值应30。否则，实验视为无效。8.2 结果判定和报告 a)Ct 值40，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出沙门氏菌；b)Ct 值35,可判定该样品结果为阳性；c)Ct 值35 而40，建议样本重做。重做结果 Ct 值40
11、 者为阴性，否则为阳性。对于阳性结果，应参见规范性引用文件中的方法或相关的国际权威微生物经典检验方法做进一步的生化鉴定和报告。9 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。并参见 GB 19489 中的有关规定执行。DB34/T 15392011 4 A A 附 录 A（规范性附录）检测过程中防止交叉污染的措施 A.1 抽样和制样过程 抽样和制样工具必须清洗干净,经 121 高压灭菌 15 min20 min。一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。A.2 检测过程 A.2.1 实时荧光 PCR
12、实验室应分为样品制备区、前 PCR 区（反应混合物配制区）、PCR 区、将模板提取、PCR 反应液配制、PCR 循环扩增等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单向进行。A.2.2 实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。A.2.3 各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。A.2.4 所有溶液、水、耗材和器具要 121、15 min 高压，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在 2025 贮存的试剂中，可加入 0.225的叠氮钠.所有试剂应该以大体积配制,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。A.2.5 DNA 模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。A.2.6 前 PCR 区中，最好能在 PCR 操作箱中加入 PCR 反应个各组分。A.2.7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA。A.2.8 可使用 UNG 酶和 dNTP 系统控制污染。A.2.9 应遵循 PCR 操作的其他要求。_
