1、ICS 11.020 C 05 备案号：58326-2018 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 396.72017 代替 DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 7 部分：啮齿动物微核试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 7:Micronucleus test in rodents 2017-11-10 发布 2017-12-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准
2、仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.72017 I 前 言 DB22/T 396保健用品毒理学评价程序与检验方法拟分为如下部分：第 1 部分：评价程序；第 2 部分：急性经皮毒性试验；第 3 部分：长期经皮毒性试验；第 4 部分：皮肤刺激性试验；第 5 部分：皮肤变态反应试验；第 6 部分：细菌回复突变试验；第 7 部分：啮齿动物微核试验；第 8 部分：小鼠精子畸形试验；第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验；第 10 部分：致畸试验；第 1
3、1 部分：致癌试验；第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。本部分为DB22/T 396-2017的第7部分。本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本部分代替DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法，与DB22/T 396-2014相比,结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术变化如下：增加了警示；增加了范围；增加了仪器与试剂；修改了标本制作方法；修改了数据处理和评价结果。本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本部分主要起草人：张晶莹、孙兰、孟令仪、宋昕恬、吴晓刚、隋自洁、高峰。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：
4、DB22/T 396-2004；DB22/T 396-2014。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.72017 1 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 7 部分：啮齿动物微核试验 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能得安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施。并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了保健用品啮齿动物微核试验评价程
5、序。本标准适用于保健用品啮齿动物微核试验检验方法。2 啮齿动物微核试验 2.1 实验动物 常选用小鼠，建议首选NIH小鼠，也可用BALB/C或昆明种等其他小鼠。一般每组10 只12 只，雌雄各半；或至少每组6 只性成熟雄性小鼠。试验前在实验动物房至少适应3 d5 d 2.2 仪器和试剂 2.2.1 仪器 2.2.1.1 生物显微镜；2.2.1.2 解剖器械；2.2.1.3 注射器；2.2.1.4 载玻片、盖玻片；2.2.1.5 纱布、滤纸等；2.2.2 试剂 2.2.2.1 小牛血清（灭活）将滤菌的小牛血清置于56 恒温水浴保温30 min 灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里。2.2.
6、2.2 姬姆萨（Giemsa）染液 成分：Giemsa 染料 3.8 g 甲醇 375 mL 甘油 125 mL 配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至 375 mL 和甘油，混合均匀，放置 37 恒温箱中保温 48 h。保温期间，振摇数次，促使染料的充分溶解，取出过滤，两周后用。2.2.2.3 1/15 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）磷酸二氢钾（KH 2 PO4）4.50 g 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.72017 2 磷酸氢二钠（Na 2 HPO412H2O）1
7、1.81 g 加蒸馏水至 1000 mL 2.2.2.4 Giemsa 应用液 取一份 Giemsa 染液与 6 份 1/15 mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成。现用现配。2.3 受试物给予途径和方法 给受试物途径尽可能同实际应用一致。一般为单次给受试物，必要时也可多次给受试物。2.4 剂量和分组 至少设三个剂量组，并设阴性和阳性对照组。高剂量组以1/2 LD50为准。如无法测得LD50可以不引起动物死亡的最大浓度下的最大容积，作为最高剂量。中、低剂量组可按高剂量组半量递减。阴性对照组可用溶媒或生理盐水。阳性对照组可用已知阳性药物如环磷酰胺。2.5 标本制作方法 2.5.1 取材 动物颈椎脱臼
8、处死后，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，擦净血污，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液。2.5.2 涂片 将骨髓液滴在载玻片一端的小牛血清液滴里，仔细混匀。一般来讲，两节胸骨髓液涂一张片子为宜。然后，按血常规涂片法涂片，长度约2 cm3 cm。在空气中晾干。若立即染色，需在酒精灯火焰上方，稍微烘烤一下。2.5.3 固定 将干燥的涂片放入甲醇液中固定 5 min。即使当日不染色，也应固定后保存。2.5.4 染色 将固定过的涂片放入 Giemsa 应用液中，染色 10 min15 min，然后立即用 1/15 mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗。2.5.5 封片 用
9、滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5 min，取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。2.5.6 观察与计数 先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞，但需用有核细胞形态染色完好做好判断制片优劣的标准。本法观察含微核的嗜多染红细胞。嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈淡桔红色。微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。每只动物至少计数 2000 个嗜多本标准仅供内部使用 不得翻印本
10、标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.72017 3 染红细胞。微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（）表示之。若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数。3 数据处理和结果评价 3.1 数据处理 报告各组微核细胞率的均数和标准差，利用适当的统计学方法如 Poinsson 分布 u 检验比较受试物各剂量组与溶剂对照组的微核率。若无证据表明所得的数据有性别间的差异，则可将两性别的数据合并进行统计分析。3.2 结果评价 在评价时应综合考虑生物学意义和统计学意义。如果受试物试验组与溶剂对照组相比，单一剂量法微核率有明显增高；多剂量法的剂量组在统计学上有显著性差异，并有剂量反应关系则可认为微核试验阳性。_ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印
