1、ICS 67.050 X 04 浙江省地方标准DB33/T 6912008水产品中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法 Determination of Oxytetracycline,Tetracycline,Chlortetracycline and Doxycycline residues in aquatic product HPLC with fluorescence detector 2008-03-12 发布 2008-04-12 实施浙江省质量技术监督局 发布 DB33DB33/T 6912008 II 前 言 本标准附录A为资料性附录。本标准由
2、浙江省水产标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：浙江省海洋水产品质量检验中心、舟山市富丹旅游食品有限责任公司。本标准主要起草人：王萍亚、周勇、张薇英、黄鹂、戴意飞、王维洁、江旭华。DB33/T 6912008 1 水产品中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留量的测定-高效液相色谱荧光检测法 1 范围 本标准规定了水产品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的高效液相色谱荧光测定方法。本标准适用于水产品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版
3、均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 样品经柠檬酸缓冲液提取，正己烷脱脂，固相萃取柱净化，用高效液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。4 试剂与材料 4.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水标准。4.2 甲醇：色谱纯。4.3 正己烷。4.4 柠檬酸。4.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.6 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）。4.7 磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）。4.8 磷酸二氢钾（
4、KH2PO4）。4.9 咪唑。4.10 醋酸镁。4.11 冰醋酸：优级纯。4.12 柠檬酸缓冲液：准确称取柠檬酸（4.3）21.0g，用水溶解稀释至 1000mL（A 液）。准确称取磷酸氢二钠（4.4）71.6g，用水溶解稀释至 1000mL（B 液）。准确称取乙二胺四乙酸二钠（4.5）1.86g，用307mL A 液和 193mLB 液溶解混匀。4.13 0.01mol/L 磷酸二氢钠溶液：准确称取 1.56g 磷酸二氢钠(4.6)，加适量水溶解，定容至 1000mL。4.14 1.36%磷酸二氢钾溶液：准确称取 13.6g 磷酸二氢钾（4.7），加适量水溶解，定容至 1000mL。4.15
5、 咪唑缓冲溶液：准确称取 68.06 g 咪唑（4.8）、0.37g 乙二胺四乙酸二钠（4.5）及 10.27 g 醋酸镁（4.9）溶于 800 mL 水中，用冰醋酸（4.10）调 pH 至 7.2，再用水定容至 1000mL，以微孔滤膜（0.45m）过滤后备用。4.16 标准品：土霉素（OTC）、四环素（TC）、金霉素（CTC）、强力霉素（DOTC），纯度99%。4.17 混合标准储备溶液：准确称取土霉素 10.0mg、四环素 10.0mg、金霉素 20.0mg，强力霉素 20.0mg，溶于磷酸二氢钠（4.12）溶液中，定容至 100.0mL，此溶液每毫升含土霉素 100g、四环素 100g
6、、DB33/T 6912008 2 金霉素 200g、强力霉素 200g。本溶液于 04保存，一周内有效。4.18 混合标准中间溶液：准确移取 4.16 中的混合标准溶液 10.0mL，用水定容至 100.0mL，配成每毫升含土霉素 10g、四环素 10g，金霉素 20g、强力霉素 20g 的混合标准中间溶液。4.19 混合标准工作溶液：以混合标准中间溶液（4.10）配制土霉素、四环素标准使用浓度系列：0.05、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0g/mL；以混合标准中间溶液（4.10）配制金霉素、强力霉素标准使用浓度系列：0.10、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0g/mL。此
7、标准工作液临用时现配。4.20 微孔滤膜，0.45m。5 仪器与设备 5.1 高效液相色谱仪：配有荧光检测器。5.2 pH 计。5.3 电子天平：感量为 0.0001g 和.01g。5.4 高速组织捣碎机。5.5 聚丙烯离心管。5.6 均质器：10000 rpm。5.7 离心机：5000 rpm。5.8 固相萃取柱：Waters Oasis HLB 小柱（6mL，200mg）或同类型小柱。5.9 固相萃取装置带负压抽滤器。5.10 旋转蒸发仪。6 分析步骤 6.1 样品制备 从原始样品中取出部分有代表性的样品，高速组织捣碎机（5.4）捣碎。四分法缩分出不少于 500g样品，混匀，均分成两份。装
8、入清洁容器，加封，标明标记。-18以下冷冻保存。6.2 提取 称取约 5g 样品（精确至 0.01g）置于 50mL 聚丙烯离心管（5.5）中，加入柠檬酸缓冲液（4.11）30mL，以 10000rpm均质 3min，再于室温下以 3000 rpm离心 10min，上清液移入 100mL 分液漏斗中，残留物用 20mL 柠檬酸缓冲液同法均质 1-3min（10000rpm），3000 rpm离心 10min，合并上清液于 100mL 分液漏斗中，加入 20mL 正己烷，振荡 5min，静置，水相转移至 50mL 容量瓶中，用柠檬酸缓冲液定容至刻度备用。6.3 净化 固相萃取小柱（5.8）预先依
9、次用 10mL 甲醇、10mL 蒸馏水、5mL 柠檬酸缓冲液活化，取 25mL 提取液(6.2 提取)上样，控制速度在 20 滴/min，10mL 蒸馏水洗涤，真空抽干，再用 15mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于 100mL 的蒸发瓶中。40以下旋转蒸发至近干，用 1mL 磷酸二氢钾溶液（4.13）溶解，经0.45m微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。6.4 色谱测定 6.4.1 色谱条件 6.4.1.1 色谱柱：C18 柱，粒度 5m，4.6mm（id）250mm，或性能相当者。6.4.1.2 检测器：荧光检测器，Ex=380nm，Em=520nm。6.4.1.3 流速：1.0mL/min。6.4.1
10、.4 进样量：50L。6.4.1.5 柱温：40。6.4.1.6 流动相：咪唑缓冲溶液（4.14）甲醇(78+22，v/v)。6.4.2 测定 DB33/T 6912008 3 标准工作溶液和样液中待测组分响应值均应在仪器检测线性范围内。标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，土霉素的保留时间约为 5.09 min，四环素的保留时间约为 6.85 min，强力霉素的保留时间约为 11.94 min，金霉素的保留时间约为 16.70 min。标准品的色谱图见附录 A。6.5 空白试验 除称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。7 计算 按式（1）计算样品中土霉素、四环素、金霉素、
11、强力霉素的含量，计算结果需扣除空白值。mVCXii=2 （1）式中：Xi样品中待测组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；Ci样品溶液中待测组分浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；m样品质量，单位为克（g）；V样品提取液最终定容体积，单位为毫升（mL）。8 检出限、回收率、精密度 8.1 检出限 本方法检出限为土霉素0.01mg/kg，四环素0.01mg/kg，金霉素0.03mg/kg，强力霉素0.03mg/kg。8.2 回收率 在样品中分别添加0.02mg/kg0.5mg/kg土霉素、四环素、金霉素、强力霉素时，回收率均为70%120%。8.3 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。DB33/T 6912008 4 附录 A（资料性附录）标准品液相色谱图 图A.四种四环素族药物的标准品液相色谱图 1.土霉素(0.025mg/L)2.四环素(0.025 mg/L)3.强力霉素(0.05 mg/L)4.金霉素(0.05 mg/L)
