1、 ICS ICS DB51 备案号：28172-2010 四川省地方标准DB51/T 10822010饲料中伏马毒素B 的测定 1高效液相色谱法 Determination of fumonisin B1 in feeds High-performance liquid chromatography 2010-06-01 发布 2010-07-01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 1082-2010 I 目 次 前 言II 1 范围1 2 规范性引用文件1 3 原理1 4 试剂和溶液1 5 仪器与设备2 6 试样制备2 7 分析步骤2 8 结果计算3 9 精密度3 附录 A 4 D
2、B51/T 1082-2010 II 前 言 本标准的附录A为资料性附录。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省饲料工作总站负责起草。本标准起草人：柏凡、李云、魏敏、王宇萍、赵立军、张静。DB51/T 1082-2010 1 饲料中伏马毒素B1的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了测定饲料中伏马毒素B1的含量的高效液相色谱法(HPLC)。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料的测定。本标准中伏马毒素B1的检出限为0.2mg/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡
3、是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样经甲醇-水提取，离心、过滤后，取滤液经过免疫亲和柱净化，经衍生化，用高效液相色谱仪-荧光检测器检测，外标法计算伏马毒素B1的含量。4 试剂和溶液 除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T6682一级用水的规定。4.1 甲醇：色谱纯。4.2 乙腈：色谱纯。4.3 乙酸：优级纯。4.4 磷酸：优级纯。4.5 盐酸。4.6 氯化钠。4.7 氯化钾。4.8 磷酸钠。4.9 磷酸二氢钠。
4、4.10 磷酸氢二钠。4.11 磷酸二氢钾。4.12 氢氧化钠。4.13 四硼酸钠：优级纯。4.14 巯基乙醇：优级纯。4.15 邻苯二甲醛：优级纯。4.16 提取液：甲醇+水=80+20（体积比）。4.17 衍生剂：称取 5mg 邻苯二甲醛，溶于 1mL 甲醇，用 0.05mol/L 四硼酸钠溶液定容到 50 mL，加入 25L 巯基乙醇，混匀，备用（4可保存一周）。4.18 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取 8.0g 氯化钠、1.44g 磷酸氢二钠、0.2g 磷酸二氢钾、0.2g 氯化钾，溶于 1000mL 水，用盐酸或氢氧化钠溶液调 pH 至 7.0。DB51/T 1082-2010 2 4
5、.19 伏马毒素B1标准品：含量大于 98%。4.19.1 标准贮备液：精密称取 10mg 伏马毒素 B1 标准品，用乙腈+水（1+1）溶解、定容至 100 mL，此贮备液浓度为 100 g/mL，置于 28冰箱中保存，有效期 6 个月。4.19.2 标准工作溶液：分别准确移取伏马毒素B1贮备液，用流动相配制成标准工作溶液：0.2g/mL，1.0 g/mL，5.0g/mL，25g/mL，50 g/mL。置于 28冰箱中保存，有效期 6 个月。注意：注1:凡接触伏马毒素B1的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCl）溶液，放置半天后清洗备用。注2:为了安全，分析人员操作时须带上医用乳胶手套，在通风橱
6、内操作。4.19.3 伏马毒素免疫亲和柱。5 仪器与设备 5.1 分析天平：感量 0.1 mg。5.2 超声波清洗器。5.3 离心机：转速为 5000 r/min 以上。5.4 超纯水处理器。5.5 涡旋混合器。5.6 高效液相色谱仪：配备荧光检测器。5.7 氮吹仪。5.8 0.45 m 滤膜。6 试样制备 按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195规定，选取具有代表性的实验室样品1kg，四分法缩减分取200 g左右，粉碎过1 mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。7 分析步骤 7.1 试样溶液的制备 7.1.1 提取 称取 20g 试样(精确至 0.01g)于锥形瓶中，加入 2g
7、 氯化钠（4.6），50mL 提取液（4.16），超声提取 20min，离心，取上清液过滤，准确量取滤液 5.0mL，加入 20mLPBS（4.18）稀释，混匀，待净化。7.1.2 净化 将免疫亲和柱底帽除去。剪去亲和柱的盖帽，与10ml注射器连接。待免疫亲和柱中缓冲液排出后，精确吸取上述稀释液5.0mL过免疫亲和柱（流速1-2滴/秒），再依次用5mLPBS缓冲液淋洗柱子，抽干柱子，用2.0mL甲醇洗脱，收集洗脱液于50水浴中氮气吹干，重新溶解于200L的甲醇+水（50+50，体积比）中，待衍生化。7.1.3 衍生化 取样品处理液和标准溶液各100L，各加300L衍生剂（4.17），混匀，过0
8、.45m滤膜，在2min内上机测定。7.2 色谱条件 7.2.1 色谱柱：C18柱，柱长 250mm，内径 4.6mm，粒度 5m；或性能相当的色谱柱。7.2.2 柱温：30。7.2.3 流动相：甲醇+磷酸二氢钠（0.1mol/L，磷酸调节 pH 至 3.3）77+23（体积比）。7.2.4 流速：0.8mL/min。7.2.5 检测器：荧光检测器，Ex：330nm，Em：440nm。7.2.6 进样量：50L。DB51/T 1082-2010 3 7.3 测定 按上述色谱条件，分别将标准溶液和试样溶液上机测定，按照保留时间进行定性，单点或多点校正，外标法定量。当分析物浓度不在线性范围内时，应
9、将分析物稀释或者浓缩后再进行检测。8 结果计算 试样中伏马毒素B1的含量X，以质量分数毫克每千克(mg/kg)表示，单点校正按式(1)计算：nmAsVCsAX=(1)式中：V上机定容体积，单位为毫升(mL)；As伏马毒素B1标准溶液对应的色谱峰面积响应值；A试样溶液对应的色谱峰面积响应值；Cs伏马毒素B1标准溶液的浓度，单位为微克每毫升(g/mL)；m试样质量，单位为克(g)；n稀释倍数。结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10%。DB51/T 1082-2010 4 附 录 A（资料性附录）伏马毒素B1标准色谱图 图A.1 伏马毒素B1标准色谱图 _
