1、 ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB22/T 9732019 代替 DB22/T 973-2002 猪霉形体肺炎检测 ELISA 法 Detection of Swine enzootic pneumoniae by enzyme-linked immunosorbent assay method 2019-07-25 发布 2019-08-15 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 9732019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本标准代替 DB22/T 973-2002 猪霉形
2、体肺炎微量全血酶联免疫吸附试验诊断技术规程，与 DB22/T 973-2002 相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：名称变更；增加了“规范性引用文件”（见 2）；修改了“原理”（见 3，2002 年版的 2）；修改“试剂”为“试剂或材料”（见 4，2002 年版的 4）；修改“仪器和材料”为“仪器设备”（见 5，2002 年版的 3）；增加了“样品”（见 6）；修改了“操作步骤”为“试验步骤”（见 7，2002 年版的 5）；修改了“结果判定”（见 8，2002 年版的 6）；增加了“附录 A”（见附录 A）。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。
3、本标准主要起草人：程荣华、邵洪泽、呼延含蓉、郭衍冰、丁世杰、李昱洁、尹德福、孙艺学。DB22/T 973-2002 的历次版本发布情况为：DB22/T 973-2002。DB22/T 9732019 1 猪霉形体肺炎检测 ELISA 法 1 范围 本标准规定了猪霉形体肺炎酶联免疫吸附试验（ELISA）的试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。本标准适用于猪霉形体肺炎的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格
4、和试验方法 3 原理 吸附于固相载体表面的抗原或抗体与被检标本中相应的抗体或抗原结合形成抗原抗体复合物，再加入酶标记的抗体（抗抗体），加入底物后，底物被酶催化成为有色产物，颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量呈正比，可根据呈色的深浅进行定性或定量检测。4 试剂或材料 4.1 试剂 除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯,试验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。4.1.1 磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录 A）。4.1.2 PBST（见附录 A）。4.1.3 猪肺炎霉形体可溶性抗原。4.1.4 蒸馏水。4.1.5 包被液（见附录 A）。4.1.6 封闭液（见附录 A）。4.1.7
5、 猪霉形体肺炎阳性血清。4.1.8 猪霉形体肺炎阴性血清。4.1.9 辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗猪 IgG。4.1.10 底物溶液（见附录 A）或等效物。4.1.11 终止液（见附录 A）。4.2 材料 4.2.1 采血针。4.2.2 滤纸。DB22/T 9732019 2 4.2.3 离心管（1.5 mL）。4.2.4 96 孔酶标板。4.2.5 封板膜。4.2.6 吸头（200 L,1000 L）。5 仪器设备 5.1 多通道可调移液器（20 L200 L）、单通道可调移液器（20 L200 L,1000 L）。5.2 恒温水浴箱 37 0.2。5.3 普通冰箱。5.4 酶标仪 测定
6、波长 490 nm。6 样品 6.1 血样的采制 猪耳静脉采血（4.2.1），用移液器（5.1）吸取（4.2.6）100 L血液于滤纸（4.2.2）上，注明耳号。自然风干，制成全血干纸片，置 4（5.3）保存或送检。6.2 血样的稀释 将干纸片按血滴大小剪下，放入离心管（4.2.3）中，加入PBST（4.1.2）2.5 mL，置4 冰箱过夜。7 试验步骤 7.1 可溶性抗原 可溶性抗原（4.1.3）加 PBS（4.1.1）稀释到 2.5 mg/mL，充分振荡混匀。7.2 包被抗原 用包被液（4.1.5）稀释抗原至工作浓度，加入酶标板（4.2.4），100 L/孔（每板 2 孔不加抗原，作为空白
7、对照），用封板膜（4.2.5）密封酶标板，37（5.2）孵育 1 h，置 4 冰箱孵育 12 h 14 h 或过夜。7.3 洗板 取出酶标板弃去板内液体。用 PBST 洗板 3 次5 次，在最后一次洗涤后，将板孔内的残留液体在滤纸上拍干。7.4 封闭 全板加封闭液（4.1.6）200 L/孔，密封酶标板，置 37 孵育 2 h。7.5 洗板 按 7.3 操作。DB22/T 9732019 3 7.6 加样 将被检样品平衡至室温。每个样品加 2 个孔，100 L/孔。每板设标准阳性对照（4.1.7）、标准阴性对照（4.1.8）和空白对照（4.1.4）各 2 孔。密封后 37，2 h。7.7 洗板
8、 按 7.3 操作。7.8 加酶标记抗体 将酶标兔抗猪IgG抗体（4.1.9）用PBST稀释至工作浓度，100 L/孔，置 37 孵育 2 h。7.9 洗板 按 7.3 操作。7.10 加底物溶液 加底物溶液100 L/孔（4.1.10），37 避光反应 20 min。7.11 终止反应 加入终止液（4.1.11）50 L/孔，终止反应。7.12 测 OD 值 以空白对照孔校正酶标仪（5.4），在波长 490 nm处测定光密度值（OD），在加入终止液后10 min内完成。8 结果判定 8.1 有效性判定 设标准阴性对照血清孔 OD 值的平均值为N，标准阳性对照血清孔 OD 值的平均值为 C，当
9、 C 比 N大于 0.3 时，实验结果有效。否则，本次试验无效。8.2 S/N 比值判定法测定 设被检样品孔 OD 值的平均值为 S，标准阴性对照血清孔 OD 值的平均值为 N。以 S/N 比值进行判定。当 S/N 比值 1.4 时，判定为阳性。当 S/N 比值 1.4 时，判定为阴性。DB22/T 9732019 4 附 录 A（规范性附录）主要试剂配制 磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L pH7.4，PBS)配制见表 A.1。表A.1 氯化钠（NaCl）8.00 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）0.20 g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.90 g 氯化钾（KCl）0.20 g 注
10、：加蒸馏水定容至1000.00 mL。PBST配制见表 A.2。表A.2 吐温 20（Tween-20）0.50 mL PBS（0.01mol/L pH7.4）1000.00 mL 包被液（0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，CBS）配制见表 A.3。表A.3 碳酸钠（Na2CO3）1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g 蒸馏水 800.00 mL 注：调整pH9.6后加蒸馏水定容至1000.00 mL。封闭液配制见表 A.4。表A.4 PBST 1000.00 mL 脱脂奶粉 50.00 g 注：加热溶解。DB22/T 9732019 5 底物溶液配制见表 A.5。表A.5 柠檬酸 1.92 g 甲液 蒸馏水 100.00 mL 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）7.17 g 乙液 蒸馏水 100.00 mL 使用液配制方法见表 A.6。表A.6 甲液 12.20 mL 乙液 12.80 mL 邻苯二胺(OPD)0.020 g 蒸馏水 25.00 mL 过氧化氢 30%75.00 L 注：加入过氧化氢后立即使用，每次使用的底物溶液需现用现配。终止液(2 mol/L硫酸液)配制见表 A.7。表A.7 硫酸（H2SO4）58.00 mL 蒸馏水 442.00 mL _
