1、 ICS 65.020.30 B 44 中 国 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 实验动物 结肠小袋纤毛虫核酸 T/CALAS 106-2021检测方法 Laboratory animalNucleic acid detection method of Balantidium 2022-01-10 发布 中国实验动物学会 2022-01-10 实施 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文
2、件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。本文件主要起草人：谢永平、贺会利、冯世文、潘艳、李军。全国团体标准信息平台 实验动物 结肠小袋纤毛虫核酸检测方法 1 范围 本文件规定了检测实验动物结肠小袋纤毛虫核酸检测法。本文件适用于实验室对实验动物（猴、鼠、兔等）粪中的结肠小袋纤毛虫核酸的快速检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件
3、。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 兽医实验室生物安全管理规范（中华人民共和国农业部公告第302号）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 环介导等温扩增 loop-mediated isothermal amplification，LAMP 简称LAMP，是一种新型恒温核酸扩增方法。LAMP法的特征是针对靶基因上的6个区域设计4条引物，利用链置换活性DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15 min60 min内完成
4、扩增，用于病原体的快速鉴定。3.1.2 特异性引物 specific primer 针对特定模板DNA片段设计一段寡核苷酸，在反应中与模板DNA特异性结合。4 试验材料 4.1 引物 根据结肠小袋纤毛虫（Balantidium coli）的18S rRNA基因设计引物，内引物全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）72（xmc-FIP、xmc-BIP）使用浓度为40 pmol，外引物（xmc-F3、xmc-B3）使用浓度为5 pmol。使用前先用无RNase去离子水稀释。引物稀释后分装成小剂量置于20保存备用。引物序列及无RNase去离子水的配制见附录A。4.2
5、仪器设备及耗材 a）灭菌试管（0.5 mL或者1.5 mL）。b）微量移液器（量程：0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1000 L）。c）生物安全柜。d）20冰箱。e）简易微量离心机。f）Loopamp实时浊度仪LA-320c。g）冰（碎冰）及冰盒。h）无菌的密封袋。i）棉拭子。j）烧杯：100 mL。k）离心管：1.5 mL、2.0 mL。l）LAMP反应管：200 L。m）移液器吸嘴：1000 L、200 L、10 L等多种规格。n）一次性手套。o）采样试管（5 mL、10 mL）。p）试管架。4.3 试剂 1.粪便基因组DNA试剂盒 用于粪便基因组DN
6、A的提取试剂（商品化试剂盒产品）。2.Loopamp扩增反应试剂盒 Loopamp扩增反应试剂（商品化试剂盒产品）。LAMP试剂如下：反应缓冲液Tris-HCl（pH 8.8）40 mmol/L、KCl 20 mmol/L、MgSO4 16 mmol/L、（NH4）2SO4 20 mmol/L、吐温-20（Tween20）0.2%、乙酸三甲铵内盐 1.6 mol/L、dNTPs 2.8 mmol/L 每种、Bst DNA聚合酶、去离子水（DW）、阳性对照DNA、引物溶液DNA。3.阳性对照DNA 用限制性内切核酸酶 Hind 消化噬菌体DNA后，取其片段（6.557 bp）重组入质粒所得。4.
7、阴性对照 阴性对照使用灭菌去离子水。全国团体标准信息平台 73 实验动物 结肠小袋纤毛虫核酸检测方法 5 样品采集、运输、处理 5.1 样品采集、运输、处理和检测的生物安全要求 有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B。5.2 样品采集 戴一次性手套用棉拭子采集新鲜的实验动物粪便，每份2.0 g5.0 g，装入无菌的密封袋或者试管中。采样过程中应戴一次性手套，采样过程中样本间避免交叉污染。每份样品标记样品编号、名称、采样时间、采集单位。5.3 样品的保存和运输 采集的样品在常温条件下保存应不超过72 h，长期保存装入灭菌容器内4保存，4保存期不超过半个月。样品运送应放在一个不透水、防泄漏的容器
8、内，保证完全密封。所有样品应随附送样单，包括样品提交人、样品来源地、动物种类和年龄、与动物有关的病史以及联系方式等。5.4 样品的预处理 取待检实验动物的新鲜粪便2.0 g5.0 g，置于灭菌烧杯充分搅匀，称取搅拌后的粪便样本100 mg300 mg至2 mL离心管中用于DNA提取或置于20保存备用。6 操作程序 6.1 待检样品 DNA 提取 将5.4预处理的粪便样本称取100 mg300 mg至2 mL离心管中，按粪便基因组DNA提取说明书提取模板DNA，获得50 L DNA。所提取的模板DNA，直接放入PCR管中进行后续反应或置于20保存备用。6.2 LAMP 样品反应体系配制 1.LA
9、MP样品反应体系 2反应缓冲液 12.5 L Bst DNA聚合酶 1 L xmc-F3 5 pmol xmc-B3 5 pmol xmc-FIP 40 pmol xmc-BIP 40 pmol 去离子水（DW）补足23 L。分装后，放入微量离心机中离心数秒（瞬时离心），以此作为预混溶液，配制好的预全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）74 混溶液立即使用。2.对照反应体系 2反应缓冲液 12.5 L 引物溶液DNA 2.5 L Bst DNA聚合酶 1 L 去离子水（DW）补足23 L。6.3 预混溶液与样本溶液混合 添加样本溶液（结肠小袋纤毛虫DNA）2 L
10、，使总量达到25 L，对照反应中，阴性对照使用去离子水2 L，阳性对照使用阳性对照DNA 2 L，合上盖子轻击使溶液充分混匀后瞬时离心。6.4 上机检测 将已配制好、分装完毕的反应管置于实时浊度仪密闭进行，浊度仪实时监控扩增情况，反应程序为63保持60 min，之后85灭活5 min。7 结果判定 实时浊度仪实时监测反应扩增情况，仪器通过读取反应管的浊度值绘制浊度曲线，在阴阳性对照成立的情况下，样品反应管出现浊度上升曲线的为阳性结果，没有出现浊度上升曲线的为阴性结果（见附录A.5）。全国团体标准信息平台 75 实验动物 结肠小袋纤毛虫核酸检测方法 附 录 A（规范性附录）特异性引物序列及检测结
11、果图示 A.1 结肠小袋纤毛虫引物扩增的目的基因 目的基因：18S rRNA基因。A.2 结肠小袋纤毛虫外引物 xmc-F3：AGAGTGTTTCAAGCAGGC xmc-B3：TCTTTGATCCCCTATCTTTCG A.3 结肠小袋纤毛虫内引物 xmc-FIP：CAACTGTCCCTATTAATCGCAATCTTACATTAGCATGGAATAACGAAT xmc-BIP：AATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTAATGAAAACATCCTTGGCA A.4 无 RNase 去离子水的配制 去离子水加入0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）混合均匀，室温静置过夜，121高压灭菌
12、15 min，冷却备用。LAMP检测结果图示 LAMP检测结果如图A.1所示。图 A.1 LAMP 检测结果图 全国团体标准信息平台A.5 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）76 附 录 B（规范性附录）操 作 规 范 B.1 检测过程中防止交叉污染的措施 B.1.1 采样和制样过程 采样和制样工具，应清洗干净，121，15 min20 min灭菌，一套清洁工具仅限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为灭菌一次性容器。B.1.2 检测过程 B.1.2.1 PCR实验室应分出试剂准备区、样品制备区、产物扩增区、产物分析区。将模板提取、LAMP反应液配制、LAMP扩增
13、及鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的操作流程应从“清洁区”到“污染区”单方向进行。B.1.2.2 实验过程中，穿实验服和戴手套，手套应及时更换。各区应有专用实验服，定期清洗。B.1.2.3 各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用且不得带出该区。B.1.2.4 所有溶液、水、耗材和器具需121，15 min20 min灭菌，避免核酸和（或）核酸酶污染。B.1.2.5 样品制备区中，在生物安全柜中加入LAMP反应各组分。B.1.2.6 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA气溶胶。B.1.2.7 样品采集、运输和处理的生物安全要求，按照GB 19489、GB/T 27401和兽医实验室生物安全管理规范的规定。全国团体标准信息平台
