1、 ICS 65.020.30 B 44 中 国 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 T/CALAS 972020 实验动物 牛棒状杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法 Laboratory animal-Detection of Corynebacterium bovis by loop-mediated isothermal amplification 2020-12-01 发布 2021-01-01 实施 中国实验动物学会 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则编写。本文件附录 A 为资料性附录。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国
2、实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、扬州大学。本文件主要起草人：冯洁、张泉、谢建芸、高诚、朱立麒、钱淼。全国团体标准信息平台 实验动物 牛棒状杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物牛棒状杆菌 LAMP 检测方法。本文件适用于实验动物牛棒状杆菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用
3、于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1 环介导等温扩增 loop-mediated isothermal amplification，LAMP 一种新型核酸扩增方法。针对靶基因上的 6 个区域设计 2 对特异引物，在链置换 DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，以特异性引物为延伸起点，于 6065恒温扩增。可在 15 min60 min 内实现 1091010倍的核酸扩增，扩增产物由一系列复杂的大小不等的 DNA 混合而成。3.2 缩
4、略语 DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）LAMP 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification）PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline）16S rRNA 16S 核糖体核糖核酸（16S ribosomal RNA）4 基本原理 采用合适的方法提取检测样本中的细菌 DNA。根据牛棒状杆菌属 16S rRNA基因序列保守区域设计一组特异性 LAMP 引物，对 DNA 模板进行扩增，根据 LAMP 扩增结果判定样品中是否含有牛棒状杆菌。全国团体标准信息平台 第三篇 实验动物检测方法系列标
5、准 150 设计的 LAMP 扩增引物包括外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP 以及环引物 LB，可特异性识别靶序列上的 6 个区域，利用 Bst DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）启动循环链置换反应，在 16S rRNA 基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有许多环的花椰菜结构的茎-环 DNA 混合物。在 DNA 合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物（dNTP）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量白色焦磷酸镁沉淀。焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，仅用肉眼观察反应液颜色变化，即可判定扩
6、增与否，无需繁琐的电泳和紫外观察。5 设备和材料 5.1 离心机：2000 r/min13 000 r/min。5.2 水浴锅或恒温孵育器：6065。5.3 超净工作台。5.4 生物安全柜。5.5 电泳仪。5.6 振荡器。5.7 组织匀浆器。5.8 冰箱：25、20。5.9 微量移液器（0.1 L2 L、1 L10 L、10 L100 L、100 L1000 L）及无菌吸头。5.10 无菌透明离心管：1.5 mL、5 mL、15 mL。5.11 LAMP 反应管（透明）。6 试剂*除特殊说明外，实验所用试剂均为分析纯或符合生化试剂标准，各溶液按照附录A所示方法进行配制。6.1 灭菌 PBS。6
7、.2 无水乙醇。6.3 钙黄绿素荧光染料。6.4 灭菌去离子水。6.5 DNA 抽提试剂：细菌基因组 DNA 提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司，货号 DP302或其他等效试剂。6.6 LAMP 试剂：LAMP DNA 扩增试剂盒（北京蓝谱生物科技有限公司，货号 SLP204）或其他等效试剂。*本章给出试剂盒相关信息是为了方便本文件使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。全国团体标准信息平台 151 实验动物 牛棒状杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法6.7 引物：包括两条外引物、两条内引物和一条环引物。根据表 1 序列合成引物，加灭菌去离子水
8、溶解，20保存。表 1 牛棒状杆菌 LAMP 检测引物序列 引物种类 引物名称 引物序列（53）正向外引物 F3 CTTTTGTGACGGTACCTGCA 反向外引物 B3 GCATTTCACCGCTACACCAG 正向内引物 FIP GGACAACGCTCGCACCCTACGAAGCACCGGCTAACTACG 反向内引物 BIP CGTCTGTGAAATCCCGGGGCCAGTCTCCCCTACAGCACT 反向环引物 LB GCAGGCGATACGGGCAT 7 检测方法 7.1 采样及样本处理 7.1.1 动物样本 采集动物皮毛、鳞屑、呼吸道分泌物、肠道内容物、粪便、病灶组织等，置于无
9、菌 1.5 mL离心管中，加入 1 mL 灭菌 PBS，经匀浆后充分振荡，3000 r/min 离心 10 min，吸取上清液转至干净离心管中编号备用。7.1.2 细菌培养物 挑取固体培养基上的可疑菌落或液体培养物，用 1 mL PBS 制备成菌悬液，置于无菌1.5 mL 离心管中编号备用。7.1.3 实验动物环境 7.1.3.1 实验动物饲料、垫料、饮水 取适量实验动物饲料和垫料置于聚乙烯薄膜袋中，加入装有灭菌 PBS 的无菌均质袋中，PBS 应将饲料和垫料完全浸没。拍击均质 1 min2 min 充分混匀，将混悬液转移至15 mL 无菌离心管中，静置 30 min，吸取上清液转至 5 mL
10、 无菌离心管中。取适量实验动物饮水直接转移至 5 mL 无菌离心管中，备用。7.1.3.2 实验动物设施设备 用灭菌棉拭子擦拭实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入 15 mL无菌离心管中，加入适量灭菌 PBS，浸泡 5 min10 min，充分混匀后取出棉拭子。离心管静置 30 min，吸取上清液转至 5 mL 无菌离心管中。7.1.4 样本的存放 采集或处理的样本在 28条件下保存应不超过 24 h，若需长期保存，应放置80冰箱，冻融不超过 3 次。7.2 DNA 提取 7.2.1 取 1 mL5 mL 上述样本，10 000 r/min 离心 1 min，吸净上清。7.2.
11、2 向菌体沉淀中加入 200 L 缓冲液 GA，振荡至菌体彻底悬浮。7.2.3 向管中加入 20 L 蛋白酶 K 溶液，混匀。全国团体标准信息平台 第三篇 实验动物检测方法系列标准 152 7.2.4 加入 220 L 缓冲液 GB，振荡 15 s，70 放置 10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。7.2.5 加 220 L 无水乙醇，充分振荡混匀 15 s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。7.2.6 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中），12 000 r/min 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入
12、收集管中。7.2.7 向吸附柱 CB3 中加入 500 L 缓冲液 GD，12 000 r/min 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。7.2.8 向吸附柱 CB3 中加入 600 L 漂洗液 PW，12 000 r/min 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。7.2.9 重复操作步骤7.2.8，向吸附柱CB3中加入600 L漂洗液PW，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。7.2.10 将吸附柱 CB3 放回收集管中，12 000 r/min 离心 2 min，倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，
13、以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。7.2.11 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50 L200 L 洗脱缓冲液 TE，室温放置 2 min5 min，12 000 r/min 离心 2 min，将溶液收集到离心管中。制备好的 DNA 应尽快进行下一步反应。若暂不能进行，应冻存于20 备用。7.3 LAMP 反应 7.3.1 反应体系 将 LAMP 反应体系中的各试剂依次加入反应管中，各试剂的量可根据具体情况或不同反应总体积进行相应调整。反应液的配制应在冰上操作。反应体系见表 2。表 2 牛棒状杆菌 LAMP 检测反应体系配制表 成分 用量/L 2反应缓冲液
14、 12.5 F3（5 mol/L）1 B3（5 mol/L）1 FIP（40 mol/L）1 BIP（40 mol/L）1 LB（20 mol/L）1 Bst DNA 聚合酶*1 钙黄绿素 1 DNA 模板 15 灭菌去离子水 补足至 25*表中给出聚合酶相关信息是为了方便本文件使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。7.3.2 反应程序 将反应管中的反应体系混匀，置于 64恒温反应 60 min。全国团体标准信息平台 153 实验动物 牛棒状杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法7.3.3 实验对照 每次反应同时设有阳性对照、阴性对照和空白对照。其
15、中，以含有牛棒状杆菌的组织或纯培养物提取的 DNA 作为阳性对照模板，以不含有牛棒状杆菌 DNA 的样本作为阴性对照模板，以灭菌去离子水作为空白对照模板。7.4 结果观察 LAMP 反应结束后，可经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析或直接目测观察反应管液体颜色变化。8 结果判定和报告 8.1 质控标准 阴性对照和空白对照反应管液体显示为橙色，阳性对照反应管液体显示为黄绿色。否则此次试验无效，需重新进行 LAMP 扩增。8.2 结果判定 8.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测 取 2 L 扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察到 LAMP 特征性的梯形带则判为阳性，未出现扩增条带则判为阴性。
16、8.2.2 目测法 LAMP 扩增结束后，肉眼观察样品反应管液体颜色，显示为黄绿色判为阳性，橙色则判为阴性。8.2.3 生物安全 检测过程中涉及实验室生物安全的实验操作及处理按照 GB 19489 规定执行，由具备相关资质的工作人员进行相应操作；检测过程中防止交叉污染的过程控制按照 GB/T 19495.2 要求执行。8.3 结果报告 根据判定结果，作出报告。全国团体标准信息平台 第三篇 实验动物检测方法系列标准 154 附 录 A （规范性附录）溶液的配制 A.1 磷酸盐缓冲液（PBS）A.1.1 A 液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4H2O）27.6 g，适量去离子水溶解，定容至 1000 mL，混匀。A.1.2 B 液 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO47H2O）53.6 g（或Na2HPO412H2O 71.6 g，或 Na2HPO42H2O 35.6 g），加适量去离子水溶解，定容至 1000 mL，混匀。A.1.3 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.2）的配制 取 A 液 14 mL、B
