1、ICs 13.100C52中华 人 民共 和 国 国家 职 业 卫 生 标 准GBz/T240.-201l化学品毒理学评价程序和试验方法第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验Pr o c e d u r e s a n d t e s t s Fo r t o x i c o Io g i。a l e v a l u a t i o n s o f c h e m i c a Is Pa r t 9:In v i t r o m a m m a l i a n c h r o m o s o m e a b e r r a t i o n t e s t11-OB-19发布2012-001实
2、施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部发 布GBz/T240.9-2011曰根据 中华人民共和国职业病防治法 制定本部分。GBZ/Tz 40化学品毒理学评价程序和试验方法 现分为以下四十四部分:第1部分:总则;第2部分:急性经 口毒性试验;第3部分:急性经皮毒性试验;第4部分:急性吸入毒性试验;第5部分:急性眼刺激性/腐蚀性试验;第6部分:急性皮肤刺激性/腐蚀性试验;第7部分:皮肤致敏试验;第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验;第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞
3、染色体畸变试验;第13部分:哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验;第14部分:啮齿类动物显性致死试验;第15部分:亚急性经口毒性试验;第16部分:亚急性经皮毒性试验;第17部分:亚急性吸人毒性试验;第18部分:亚慢性经 口毒性试验;第19部分:亚慢性经皮毒性试验;第部分:亚慢性吸人毒性试验;第21部分:致畸试验;第22部分:两代繁殖毒性试验;第23部分:迟发性神经毒性试验;第24部分:慢性经 口毒性试验;第25部分:慢性经皮毒性试验;第26部分:慢性吸人毒性试验;第27部分:致癌试验;第28部分:慢性毒性/致癌性联合试验;第29部分:毒物代谢动力学试验;第30部分:皮肤变态反应试验-局
4、部淋巴结法;第31部分:大肠杆菌回复突变试验;第32部分:酵母菌基因突变试验;第33部分:果蝇伴性隐性致死试验;第34部分:枯草杆菌基因重组试验;第35部分:体夕 卜 哺乳动物细胞程序外DNA合成(UDs)试验;第36部分:体内哺乳动物外周血细胞微核试验;亠刖GBz/T240.9-201l第37部分:体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验;第38部分:体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换试验;丁第39部分:精子畸形试验;一第如部分:繁殖/生长发育毒性筛选试验;工一第狃部分:亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验;第42部分:一代繁殖试验;第43部分:神经毒性筛选组合试验;第狃部分:免疫毒性试验。本部
5、分为GBz/T240的第9部分。本部分的附录A是资料性附录。本部分由卫生部职业卫生标准专业委员会提出。本部分由中华人民共和国卫生部批准。本部分起草单位:广西职业病防治研究所、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本部分主要起草人|葛宪民、孙金秀、常兵、林铮。GBz/T240.92011化学品毒理学评价程序和试验方法第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验1 范围GBZ/T240的本部分规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 目的、试验概述、试验方法、数据处理与结果评价、评价报告和结果解释。本部分适用于检测化学品可能引起的细胞遗传学毒性:2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
6、凡是注 日期 的引用文件,仅所注 日期 的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBz/T224 职业卫生名词术语GBZ/T240.1 化学品毒理学评价程序和试验方法 第1部分:总则3 术语和定义GBz/T2401界定 的术语 和定义适用 于本文 件。3.1染色体 型畸变 c h m m o s o m t y p e a b e a t i o n在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的结构改变。3.2染色单体型畸变 c h m m a t i d-t y p e a b e r a t i o n染色单体断裂或染色单体断裂重组的结构损
7、伤改变。3.3染色体数 目畸变 c h m m o s o m a 1m u m e r i c a a b e r a t 二o n染色体数 目发生改变,不同于正常核型。3.4染色体结构 畸变 c h r o m o s o m a 1“r u c t u r e a b e r m t 二o n通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂 中期的染色体的结构变化。如染色体中间缺失和断片,染色体互换和内交换等。3.5有丝分裂指数 m i t o t i c“d e x中期相细胞数与所观察的细胞总数之 比值,是一项反映细胞增殖程度的指标。4 试验 目的通过检测受试样品诱发体外培养的哺乳动物细胞
8、染色体畸变的能力,从而评价受试样品的致突变性。1GBz/T240.9-20115 试验概述在加或不加人代谢活化系统的条件下,使培养的哺乳动物细胞暴露于受试样 品中。用 中期分裂相阻断剂(如秋水仙素)处理,使细胞停止在 中期分裂相,随后收获细胞、制片、染色、分析染色体畸变。6 试验方法6.1 受试样 品处理受试样品一般应新鲜配制固体受试样 品应溶解或悬浮于适合的溶剂中,并稀释至6.2 剂量水 平受试样品至少应细胞毒性的受试样品,其剂量范围应包少细胞计数或有丝分裂指数(均应大L/m L、5m g/m L胞完整性和生长或0。01m o l/L。情况的指标,如相件下测定细胞毒性。对于相对不以上的一个浓
9、度影响观察。中溶解度限值别,但沉淀不能6.3 对 照组6.3.1 阳性对照可根据受试样重复的阳性结果。可检 出的、并可当不存在外源性甲磺酸 甲酯(甲磺酸乙酯(e t丝裂霉素C(m y乙基亚硝基脲(e t h y硝基喹啉-N-氧化物(当存在外源性活化系统时,可使一苯并(夕)芘(b e n z o(a)p y r e n e);环磷酰胺(c y c l o p h o s p h a m i d e)等。6.3.2 阴性对照D 介质对照:介质应为非致突变物,不与受试样品发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。首选介质是水或水溶性溶剂,亦可使用二甲基亚砜(DMSO),但浓度不应大于0.5%。b)空
10、白对照:如果没有文献资料或历史资料证实所用介质无致突变作用时应设空 白对照。6.4 细胞株可选用中国地 鼠肺(CHL)细胞株或卵巢(CHO)细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋 巴细胞(l y m 2r r o q u i n。l I对照物有:受试样品可直接使在或不存应采用最s u l p h o n a t ee s u l p h n a t c);GBz/T240.9-2011p h o c y t e)。一般推荐使用 中国地 鼠肺(CHL)细胞株。6.5 试剂配制6.5.1 培 养 液 MEM(Ea g Ie)加入非必需氨基酸和抗菌素(青霉素按100IU/m L、链霉素100u g/m L
11、),胎牛血清或小牛血清按10巧加人。也可选用其他合适的培养液。6.5.2 代谢活化系统大鼠肝微粒体酶S,其诱导6.5.3 0。00%秋水仙素取40m g 秋水仙6.5.4 0.075m o I/6.5.5 固定 液甲醇:冰6.5.6 姬姆 萨取姬姆萨125m L甘油,为姬姆萨染液配成其应用液磷酸盐缓第一完全溶解后,再加滤,2周后使用,作液(p H6.8)混合,液。第二液溶液。取第一液49缓冲液。6.6 试验步骤6.6.1 细胞培养与染试验需在加人和不加的细胞接种于培养皿(瓶)中,放C02培养箱 内培养。试验浓度 的受试样 品、S9混合液(不加S9混合液时,需用培养液补足茚印汜 放培养箱 中,根
12、据细胞周期决定处理洗细胞3次,加人含10%胎牛血清的培养液,2h 6h。结束后,吸去含受试样品的培放 回培养箱,于24h 或 48h 内收获细胞。作用时间为4h,终浓度为1u g/m L)。收获前2h 4h,加人细胞分裂 中期 阻断剂(女口 用秋水仙素,如果在上述加人和不加人s 9混合液的条件下均获得阴性结果,则需加做长时间处理 的试验,即在没有S9混合液的条仵下,使受试样品与试验系统的接触时间延长至24h。当难 以得 出明确结论时,应更换试验条件,如改变代谢活化条件、受试样品与试验系统接触时间等重复试验。6.6.2 收获细胞与制片6.6.2.1 消化:用0.25%胰蛋 白酶溶液消化细胞,待细
13、胞脱落后,加人含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋 白酶的作用,混匀,放人离心管以1000r/m i n 1200r/m i n 的速度离心5m i n 7m i n,弃去备方法见附录A。去培养 ,加人=定量不含血清的m L无菌0.85%氯化钠溶液中1:l,临用甲醇至375使用时,取o l/L磷15m o l/L氢二钠二氢钾成l/15下进行。试验前一天GBz/T240.92011上清液。6.6.2.2 低渗:加人0.075m o l/L KCl 溶液7m L,用滴管将细胞轻轻地混匀,放人37水浴中低渗处理10m i n 15m i n,加人2m L固定液(甲醇:冰醋酸3:D混匀,以1500r
14、/m i h 速度离心5m i n 7m i n,弃去上清液。6.6.2.3 固定:加入7m L固定液,混匀后固定7m i n,以1500r/m i n 速度离心7m i n,弃去上清液。用同法再 固定1次 2次,弃去上清液。6.6.2.4 滴片:加人数滴新鲜 固定液,混匀。用混悬液滴片,自然干燥。6.6.2.5 染色:用姬姆萨染液染色。6.6.3 镜检每一剂量组选择200个分散 良好的中期分裂相,在显微镜油镜下进行读 片。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数 目,对于畸变细胞还应记录显微镜视标位置及畸变类型。所有处理组、阳性和阴性对照组均需测定有丝分裂指数。每一剂量组应分析不少于1000个分
15、散 良好的中期分裂相。7 数据处理与结果评价7.1 数据处理结果数据的计算指标包括每个细胞染色体畸变数、染色体结构异常百分率、各剂量组及对照组不同类型染色体异常数与频率等。分裂细胞数应另计,一般不包括在总异常频率 中。所得各组 的染色体畸变率用X2检验进行统计学处理,以评价剂量组和对照组之间是否有显著性差异。7.2 结果评价在下列两种情况下可判定受试样品在本试验系统 中为阳性结果:a)受试样品引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义,并有与剂量相关的增加;b)受试样品在任何一个剂量条件下,引起染色体结构畸变数 的增加具有统计学意义,并有可重复性。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。8 评价报告
16、除GBZ/T240.1规定的一般项 目外,评价报告还应包括 以下 内容:a)所用溶剂及其配制、剂量选择(应说明受试样品的细胞毒性测定方法、溶解情况等);b)细胞株名称;c)试验条件和方法;代谢活化系统所用酶诱导剂、来源及S9混合液配方;培养液名称与血清类别和使用溶解情况;阳性对照物名称和选用浓度,阴性(溶剂)对照物名称及使用浓度;接种的细胞密度 以及所用培养皿(瓶)的规格;中期分裂阻断剂名称、所用浓度和作用时间;受试样品与试验系统的接触时间。d)简述制片方法;c)毒性特征、细胞周期资料、分裂指数、受试样品的p H值、畸变(包括裂隙分析)、各试验组(剂量组、阳性组、阴性组)染色体畸变数 目及畸变类型、畸变范围、剂量-反应关系、统计处理方法、本实验室历史上的染色体畸变率范围、均值和标准差(说明样 品数);遮GBz/T240.92011f)结论。9 结果解释阳性结果表明受试样品在该试验条件下可引起所用哺乳动物细胞染色体畸变。阴性结果表明在该试验条件下受试样品不引起所用哺乳动物动物细胞染色体畸变。GBz/T240.9-2011附 录 A(资料性附录)大鼠肝微粒体酶的诱导和s 9的制备A。1 诱
