1、中华 人 民 共 和 国 国家 标 准f饲料中细菌总数的测定方法G B 1 3 0 9 3 一 9 1Me t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f a e r o b i cb a c t e r i a l c o u n t i n f e e d s本标准参照采用国际标准I S O 4 8 3 3-1 9 7 8 食品和动物饲料中微生物学检验方法。1 主肠内容与适用范围 本标准规定了饲料中细菌总数的测定方法。本标准适用于饲料中细菌总数的测定。2 原理 将试样稀释至适当浓度，用特定的培养基，在3 0 士1 下培养7 2 士3 h，计数平板中长出
2、的菌落数，计算每克试样中的细菌数量。3 仪器、设备3.1 天平:感量为。.1 B=3.2 振荡器:往复式。3.3 干热灭菌箱:5 0 -2 0 0 士1 0C。3.4 高压灭菌锅。3.5 冰箱:普通冰箱。3.6 恒温箱:3 0 士1 C。3.7 电炉:可调式。3.8 平皿:直径为9 c m.3.9 吸管:容量为1,1 0 m L,3.1 0 三角烧瓶:容量为2 5 0,5 0 0 m L,3.1 1 玻璃珠。3.1 2 试管:1 8 X1 8 0 ra m.3.1 3 水浴锅:4 6 士1 C。3.1 4 酒精灯。3.1 5 试管架。3.1 6 橡皮乳头。4 检验程序细菌总数的检验程序如下国家
3、技术监仔局1 9 9 1 一 0 7 一 1 6 批准1 9 9 2 一 0 4 一 0 1 实施G B 1 3 0 9 3 一 9 15 操作步骤5.1 采样 采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口 瓶，金属勺和刀，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。根据饲料仓库、饲料垛的大小和类型，分层定点采样，一般可分三层五点或分层随机采样，不同点的样品，充分混合后，取5 0 0 g 左右送检，小量存贮的饲料可使用金属小勺采取上、中、下各部位的样品混乙、口0 海运进口 饲料采样:每一船仓采
4、取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛饲料超过1 0 0 0 0 t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。5.2 试样稀释及培养5.2.1 无菌称取试样1 0.0 g，放人含有9 0 m L稀释液的灭菌三角烧瓶内(瓶内预先加有适当数量的玻璃珠)。经充分振摇，制1:1 0 的均匀稀释液。最好置振荡器中以8 0 0 0 1 0 0 0 0 r/m i n的速度处理2 -3m in,5.2.2用1 m L灭菌吸管吸取1:1 0 稀释液1 m L,沿管壁慢慢注人含有9 m L稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，作成1:1 0 0 的稀
5、释液。5.2.3 另取一支1 m L灭菌吸管，按上述操作顺序，作1。倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支吸管。5.2.4 根据饲料卫生标准要求或对试样污染程度的估计，选择2-3 个适宜稀释度，分别在作1 0 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 m L稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。5.2.5 稀释液移入平皿后，应及时将凉至4 6 士1 的平板计数用培养基(可放置4 6 士1 水浴锅内保温)注入平皿约1 5 m L，小心转动平皿使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过1 5 m i n,如估计到试样中所含微生物可能在琼脂平板表面生长时，待琼脂完全
6、凝固后，可在培养基表面倾注G B 1 3 0 9 3 一 9 1凉至4 6 土1 C的水琼脂培养基4 mL e5.2.6 待琼脂凝固后，倒置平皿于3 0 士1 恒温箱内培养7 2 士3 h 取出，计数平板内菌落数目，菌落数乘以稀释倍数，即得每克试样所含细菌总数。5.3 菌落计数方法 作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时借助于放大镜检查，以防遗漏。在计数出各平板菌落数后，求出同一稀释度两个平板菌落的平均数。菌落计数的报告 选取菌落数在3 0-3 0 0 之间的平板作为菌落计数标准。每一稀释度采用两个平板菌落的平均数，如两个平板其中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板
7、作为该稀释度的菌落数，如片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2 以代表全平板菌落数。6.1 稀释度的选择6，.1 应选择平均菌落数在3 0 3 0 0 之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。6.1.2 如有两个稀释度，其生长的菌落数均在3 0 -3 0 0 之间，视两者之比如何来决定，如其比值小于2,应报告其平均数;如大于2，则报告其中较小的数字。6.1.3 如所有稀释度的平均菌落数均大于3 0 0，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.1.4 如所有稀释度的平均菌落数均小于3 0，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.1.5 如所有稀
8、释度均无菌落生长，则以小于()1 乘以最低稀释倍数报告之。6.1.6 如所有稀释度的平均菌落数均不在3 0-3 0 0 之间，其中一部分大于3 0 0 或小于3 0 时，则以最接近3 0 或3 0 0 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.2 结果报告 菌落在1 0。以内时，按其实有数报告;大于1 0 0 时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用1 0 的指数来表示。G B 1 3 0 9 3 一 9 1 附录A稀释液和培养荃制备 (补充件)除特殊规定外，本标准所用化学试剂为分析纯;生物制剂为细菌培养用，水为蒸馏水或无离子水。要求在试验条
9、件下，所用试剂应无抑制细菌生长的 物质存在。A 1 稀释液A l.1 成分 氯化钠(G B 1 2 6 6)8.5 g 蛋白 陈Lo g 蒸馏水1 0 0 0 m LA 1.2 制法 将上述成分加热溶解，校正p H使其在灭菌后保持7.0 士2。按9 m L/支分装于试管，9 0 m L/瓶分装于三角烧瓶中，塞上棉塞包扎后1 2 1 士1 高压灭菌2 0 m i n,A 2 平板计数用培养基A 2.1 成分 蛋白陈 酵母浸膏 无水D-葡萄糖 琼脂 蒸馏水A 2.2 制法 将上述成分加热溶化高压灭菌2 0 m i n,5.0 g 2.5 g 1.0 g 9 1 8 g1 0 0 0 mL，校正p H使其在灭菌后保持7.。士2。过滤、分装三角烧瓶中，包扎后1 2 1 士1 0CA 3 水琼脂培养荃A 3.1 成分 琼脂9-1 8 g 蒸馏水1 0 0 0 m LA 3.2 制法 加热使琼脂溶化，校正p H使其在灭菌后保持7.。士2。分装三角烧瓶中，包扎后1 2 1 士1 高压灭菌2 0 mi ne 上述稀释液和培养基如不马上使用，应保存在。-5 下，时间不超过一个月。附加说明:本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由西北农业大学兽医系负责起草。本标准主要起草人 五 英珍。
