1、I C S 6 5.0 2 0.2 0B61荡黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B/T 1 9 5 6 4-2 0 0 4 落叶松种子鉴定实验方法 随机扩增多态性D N A法 E x p e r i m e n t a l i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d f o r s p e c i e s o f l a r c h s e e d-R A P D2 0 0 4-0 6-2 2 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施 串 督留 瞥 臀 瓣 瞥袅 臀臀暴 发 布 G B/T 1 9 5 6 4-2 0 0 4 前 合 r勺本标
2、准的附录 A为规范性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究 中心（黑龙江）、黑龙江省质量技术监督局。本标准主要起草人：王庆贵、徐晶、姜雯、李光宇、石绍业、王卫国。G B/T 1 9 5 6 4-2 0 0 4 引言 目 前，我国林木种子的鉴定多采用感官鉴定、理化水平鉴定等方法。这些方法所需 的检验周期较长，不具备分子水平鉴定的诸多优点。随着分子生物学的发展，特别是 2 0 世纪 9 0年代以来，分子生物学的相关技术已被广泛应用，其检测对象为D N A大分子生物的遗传基础。以D N A为检测对象，具有许多其他检测水平所不具备的优点：首先，可供探测 D
3、 N A标记的数量可能是无限的，这是同工酶技术所无法 比拟的；其二，D N A分析技术不像其他技术那样随组织或发育阶段而异，植物体任何部位、任何时期提供 的 D N A均可用于分析，其检测结果都是一样的；第三，D N A分析不受环境影响，其变异只源于等位基因 D N A序列 的变异，这种稳定性便于揭示品种间的遗传变异，从而排除了环境变异所造成的表型变异。基于上述优点，D N A分析技术是农、林、牧、渔等品种鉴定的先进方法。G B/T 1 9 5 6 4-2 0 0 4 落叶松种子鉴定实验方法 随机扩增多态性D N A法1 范圈 本标准规定了落叶松种子鉴定的具体实验方法。本标准适用于利用随机扩增
4、多态性 D NA(R A P D）法对落叶松种子鉴定 的实验过程。2 术语、定义和缩略语2.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2.1.1 聚合醉链式反应p o l y m e r i s e c h a i n r e a c t io n 一种可以从少量至一个拷贝的特定碱基顺序的 D N A片断在体外花费几个小时即可扩增出数百万个分子的酶催化反应，即D N A合成反应。2.1.2 随机扩增多态性D N A r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i c D N A 是以聚合酶链式反应为基础，用随机排列的寡聚脱氧核昔酸单链作为引
5、物扩增基因组中不同位点的D N A，进而揭示多个位点等位基因间多态性的一种分子标记方法。2.1.3 核昔酸n u c le o t i d e 是构成核酸的基本单元，由三部分组成：五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基。2.1 4 引物 p r i m e r 一条互补结合在模板D N A链上的短的单链，提供3 -O H末端作为D N A合成的起点，延伸合成模板 D N A的互补链。2.1.5 多态性 p o l y m o r p h i s m 一对引物在两个或两个 以上不 同材料基 因组 D N A之间扩增，得 到数 目不同或长度不同的 D N A片断。2.2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。R
6、A P D 随机扩增多态性D N A(R a n d o m A mp l i f i e d P o l y m o r p h i s m D N A)P C R 聚合酶链式反应（P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n)D N A 脱氧核糖核酸（D e o x y r i b o n u c l e i c A c id)O D 光密度（O p t i c a l D e n s i t y)R N A核糖核酸（R i b o n u c l e i c A c id)T B E 三经基氨基甲烷一 翻酸一 乙二胺四乙酸二钠（T r i s
7、 B o r ic-a c i d E D T A)G B T 1 9 5 6 4-2 0 0 43 实验方法3.1 原理 D N A是生物体的遗传物质，携带所有的遗传信息，从D N A分子水平上进行鉴别是区 分物种、品种甚至个体之间差异的最为有效的方法。利用P C R技术可以将D N A片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍，从而达到可以检测的目的。R A P D方法是在P C R技术基础上采用随机核昔酸序列作为引物，扩增基因组D N A，这些扩增的D N A片段多态性便反应了基因组相应区域D N A的多态性，根据扩增片断长度和片断多少所表现的差异，鉴定某一物种和品种。3.2 环境条件 a)温度
8、：1 5 0C-2 5 0C；b)相对湿度：相对湿度（R H）不大于5 0 Y o.3.3 仪器 a)P C R扩增仪；b)紫外分光光度计；c)高速台式离心机：转速不小于1 5 0 0 0 r/m i n;d)多用电泳仪及水平式电泳槽；e)紫外透射仪；f）微量移液器：规格为0.1 p L-2.5 p L,2 p.L-2 0 p.L,2 0 IA L -2 0 0 p.L,1 0 0 K L-1 0 0 0 p.L;g）电子天平：分度值为0.0 0 0 1 g;h）磁力加热搅拌器；i)凝胶成像系统；J）超纯水系统；k）灭菌锅；1)酸度计：最大允许误差为士0.1 p H;m）微波炉；n）恒温水浴锅
9、：最大允许误差为士1 0C;0)恒温干燥箱：最大允许误差为士1 0C,3.4 试剂和耗材3.4.1 试剂 a)T a g D NA聚合酶：保存条件为一2 0 士2 C；b)1 0 X B u f f e r：保存条件为一2 0 士2 0C；c）四种脱氧核昔酸（(4 X d N T P)：保存条件为一2 0 士2 C;d)M扩十：保存条件为一2 0 士2 V；e)R N A酶（无D N A酶）：保存条件为一2 0 士2 C；f）琼脂糖（a g a r o s e)；g）三经甲基氨基甲烷（T r i s)：分子式为C 4 H N 0 3;h）乙二胺四乙酸二钠（E D T A N a t 2 H 2
10、 0)：分子式为C 1 o H 1 4 N z 0$N a z.2 H2 0;i)澳酚蓝（b r o m p h e n o l b l u e s o d i u m s a l t)：分子式为C,o H,B r 4 0 5 S N a;J）二甲苯青F F(x y l e n e c y a n o l e F F)：分子式为C 25 H 2,N 2 0 6 S 2 N a;k)8-经基喳琳(h y d r o x y q u i n o l i n e)：分子式为C 9 H,N O;1）十二烷基磺酸钠（S D S)：分子式为C 1 2 H a s O a S N a;m)滨化乙锭（E B)
11、：分子式为q1 H2 o N 3 B r;G B J T 1 9 5 6 4-2 0 0 4 n）异戊醇：分子式为C S H O H;o)结晶酚(p h e n o l)：分子式为C 6 H s O，保存条件为一2 0 士2 C;P)三抓甲烷：分子式为C H C l 3，纯度为分析纯；q)硼酸（b o r i c a c i d)：分子式为H 3 B 0 3，纯度为分析纯；r）蔗糖（s u c r o s e)：分子式为 C 1 2 H 2 2 0 1 1，纯度为分析纯；s)无水乙醇：分子式为 C Z H S OH，纯度为分析纯；t)盐酸：分子式为 H C l，纯度为分析纯；u)抓化钠：分子式
12、为N a C l，纯度为分析纯；v)水：分子式为 H 2 O。本实验所用水均为去离子水。3.4.2 耗材 a)离心管：规格为1.5 m L,O.2 m l,。使用前需进行高压灭菌（按第A.1 章中规定的方法进行操 作）；b）研钵：规格为直径 7 c m-1 0 c m;c)移液器吸头：规格为2 0 li L,2 0 0 Ii L和1 0 0 0 K L。使用前需进行高压灭菌；d）容量瓶：规格为1 0 0 m L,1 0 0 0 mL;e）烧杯：规格为1 0 0 ml.;f)三角烧瓶：规格为 2 5 0 m L;g)P E手套；h)锡箔纸；i）封口膜。3.5 实验程序3.5.1 D N A的提取
13、3.5.1.1 取落叶松种子5 粒g 粒，放在1.5 m L离心管中，加人6 0 0 tL L匀浆缓冲液（按第 A.2 章中规定的方法进行配制）浸泡 2 h，倒人研钵中充分研磨，将研磨产物倒人 1.5 m L离心管中，取少量匀浆缓冲液冲洗研钵，一并倒人离心管中，离心（转速为4 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n，将上清液移至新的1.5 m L离心管中，弃沉淀。3.5.1.2 加人与上清液等体积的饱和酚（按第A.3章中规定的方法进行配制），缓慢颠倒离心管2 0 m i n，避免剧烈振荡。3.5.1.3 离心（转速为8 0 0 0 r/rn i n)1 0 min，将上清液移至新的离心
14、管中。3.5.1.4 加人与上清液等体积的酚一 三氛甲烷一 异戊醇（体积比为 2 4=2 3:1)，离心（转速为8 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n，将上清液移至新的离心管中。3.5.1.5 加人与上清液等体积的三抓甲烷一 异戊醇（体积比为2 3 z 1)，缓慢颠倒1 0 m i n，离心（转速为8 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n，取上清液至新的离心管中。3.5.1.6 加人上清液二倍体积的冰冷乙醇，水平旋转离心管5 0 圈1 0 0圈，即可出现白色絮状D N A,3.5.1.7 将离心管置于一2 0 冰箱中 3 0 m i n，取出后离心（转速为 8 0 0 0
15、 r/m i n)1 0 m in，形成白色沉淀。3.5.1.8 倒掉离心管中的液体，加人 1 m L 7 5 乙醇，离心（转速为1 5 0 0 0 r/m i n)5 m i n，倒掉乙醇，倒置在干净的吸水纸上，吸干液体。3.5.1.9 将离心管置于恒温干燥箱（(4 0 0C-5 0 0C）中2 0 m i n或置于通风处4 0 m i n，使乙醇挥发。3.5.1.1 0 加人1 0 0 p L T E 缓冲液（按第A.4 章中 规定的方法进行配制）和R N A酶2 I.A L（按第A.5 章中规定的方法进行配制），水浴（5 5 士2 0C)1 2 h，使 D N A沉淀充分溶解，4 冰箱中
16、保存。3.5.2 D N A浓度的检测3.5.2.1 紫外吸收检侧 D N A分子中的嗦吟环和喻吮环能够吸收紫外光。D N A 的紫外吸收高峰在波长 2 6 0 n m处，蛋 白质的吸收高峰在波长2 8 0 n m处。取3.5.1 中提取的D N A溶液5 j.L，加水9 9 5 K L，放人比色杯中，用G B/T 1 9 5 6 4-2 0 0 4紫外分光光度计检测，记下 2 6 0 n m 和 2 8 0 n m下的 O D值，计算出 D N A 的浓度以及 o l)8 。和 O 玖、的比值。D N A的O D z so/O D z s。最好在1.8 左右，1.5以上也可用于R A P D-P C R分析，若比值太小应重复3.5.1.2 -3.5.1.1 0 步骤继续抽提。D N A浓度按公式（1)计算：D 二 5 0 X 1 0 0 0 X O D z 6 o X s ，二。一，一（1）式中：D-D N A的浓度，单位为纳克每微升（n g 扭L);s 稀释倍数。3.5.2.2 凝胶电泳检测 将制备好的浓度为。.7 的琼脂糖凝胶（按第A.6 章中规定的方法进行配制）放人电泳槽中，使
