1、I C S6 5 0 2 0 0 1B1 6囝圄中华人民共和国国家标准G B T2 8 0 9 6-2 01 1木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fX a n t h o m o n a sa x o n o p o d i sp v m a n i h o t i s(B o n d a r)V a u t e r i ne ta 1 2 0 11-1 2-3 0 发布2 0 1 2 0 6 0 1 实施丰瞀鹳紫瓣警矬瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促1 9刖置G B T2 8 0 9 6-2
2、01 1本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(S A C T C2 7 1)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李伟东、封立平、刘福秀、韩玉春、周先超、粟寒、吴翠萍、王英超。1 范围木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法G B T2 8 0 9 6-2 01 1本标准规定了植物检疫中木薯细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于木薯种子、苗木、种茎和其他繁殖材料中木薯细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文
3、件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B T4 7 8 9 2 8 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 木薯细菌性萎蔫病菌基本信息中文名：木薯细菌性萎蔫病菌(地毯草黄单胞杆菌木薯致病变种)。学名：X a n t h o m o n a sa z o n o p o d i sp v m a n i h o t i s(B o n d a r)V a u t e r i n JH o s t e，K e r s t e r s S w i n g s1 9 9 5。异名：B a c
4、i l l u sm a n i h o t i sA r t h a u d B e r t h e ta n dB o n d a r1 9 1 2，P h y t o m o n a sm a n i h o t i s(B e r t h e ta n dB o n d a r)V i e g a s，X a n t h o m o n a sm a n i h o t i s(B e r t h e ta n dB o n d a r)S t a r r1 9 4 6，X a n t h o m o n a s c a m p e s t r i sp v m a n i h o t
5、 i s(A r t h a u da n dB o n d a r)D y e1 9 7 8。病害英文名：b a c t e r i a lb l i g h to fc a s s a v a，c a s s a v ab a c t e r i a lb l i g h t。属原核生物界P r o c a r y o t e s、变形细菌门P r o t e o b a c t e r i a、y-变形细菌纲G a m m a p r o t e o b a c t e r i a、黄色单胞菌目X a n t h o m o n a d a l e s、黄色单胞菌科X a n t h o
6、 m o n a d a c e a e、黄色单胞菌属X a n t h o m o n a s、地毯草黄单胞杆菌X a n t h o m o n a sa x o n o p o d i s。病菌的远距离传播主要靠带菌种子、苗木和种茎。绝大多数木薯病种子不表现任何症状，病菌以休眠状态存在于种子的胚部和种皮。木薯细菌性萎蔫病菌的其他信息参见附录A。4 方法原理该病害症状、病菌生物学特性、生理生化特性、致病性测试和基因组D N A 的特异性P C R 检测是该病菌检测鉴定的依据。5 仪器和用具5 1 仪器电子天平、实体显微镜、超净工作台、温控培养箱、高压灭菌锅、微生物自动鉴定系统、P C R
7、仪、电泳仪、紫外检测仪或凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅(3 0 9 5)、超低温冰箱、普通冰箱、纯水机、涡旋振荡器、可调微量加样器。1G B T2 8 0 9 6-2 01 15 2 用具解剖刀、裁纸刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、放大镜、手术剪、镊子、接种环等。6 化学试剂6 1 试剂次氯酸钠(N a C i O)、磷酸二氢钠(N a H：P O。)、7 0 乙醇、吐温一6 0、吐温一8 0、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖，P C R 检测所需试剂(参见附录B)。6 2 培养基C T A 和L P G 培养基及配制(见附录c)。7 检测鉴定7 1 症状检查首先观察植株是否萎蔫，接
8、着仔细检查植株的嫩芽、茎、叶等各个部位，嫩芽、叶是否出现凋萎；叶片是否出现水渍状，暗绿色多角形的小斑，褐色或深褐色由黄晕围绕的不规则形的病斑，凋萎，干枯脱落；嫩茎和叶柄是否有水渍状，黑褐色下陷的病斑；横切茎干，检查其维管束组织是否变褐坏死、病部受挤压后是否有菌脓溢出。7 2 快速初筛对出现典型症状的植株直接进行病菌分离；对症状不典型或不明显的木薯种子、苗木和种茎应用P C R 法进行快速初筛。从植物组织(种子或叶片或种茎)中抽提总核酸，用木薯细菌性萎蔫病菌标准菌株作阳性对照，用地毯草黄单胞杆菌其他致病变种的标准菌株和健康植株抽提总核酸作阴性对照，用超纯水作为空白对照，进行P C R(方法步骤见
9、附录C)检测分析。若P C R 检测结果为阳性，继续进行7 3；若P C R 检测结果为阴性，则可判定为未检出。7 3 病菌分离7 3 1 种子带菌的分离称取木薯种子样品2 0g，置于1 次氯酸钠溶液浸泡消毒2m i n 4r a i n，无菌水洗涤三次，然后将种子磨碎，装入一灭菌的三角瓶中，加入1 0 0m L 灭菌的0 1m o l L 磷酸二氢钠缓冲液，混匀，2 5 下静置过夜，次日用该溶液在事先制备好的C T A 平板培养基上划线，3 0 恒温培养4 8h 后，检查并筛选培养基上的菌落。7 3 2 病组织(病叶或茎段)中病菌的分离将病组织切成3m m 见方的小块，先用7 0 乙醇浸泡3
10、 0S，捞出后用1 次氯酸钠溶液浸泡2m i n，再用无菌水洗涤三次，最后把病组织置于消毒的小培养皿(直径6c m)中，加几滴无菌水，捣碎，静置1 0 m i n 1 5 r a i n，制成悬浮液，用接种环蘸取汁液在C T A 平板上划线，3 0 下培养2d 后，检查并筛选培养基上的菌落。2G B T2 8 0 9 6-2 0117 3 3 形态特征病菌为革兰氏阴性，菌体短杆状，大小(o 3b o m b 0 4t u r a)(1 1p m 1 2p m)，多数单个排列，少数3 个4 个连接成短链。不产生芽孢，无荚膜。鞭毛单根极生。在C T A 培养基上生长的菌落呈灰白色到奶油色，隆起，光
11、滑，有光泽，边缘整齐，培养2d 菌落直径可达1m i t t。开始时菌落透明，渐渐混浊不透明，最后变成表面有一层粘质的固体物。在L P G 平板上恒温(2 7-2 8)培养5d，茵落突起，表面光滑，乳白色，有光泽，菌落边缘完整，直径3m m 5m m，粘稠。如果发现可疑的菌落，采用平板划线法，即用灭菌的接种环蘸取C T A 平板上菌落后，在L P G 平板上多次划线纯化，在3 0 下恒温培养2d 4d，纯化三次后进行鉴定。7 4 革兰氏染色按G B T4 7 8 9 2 8 中2 2 的方法进行革兰氏染色反应。若染色结果为革兰氏阴性菌，则进行下一步检测。7 5 生理生化指标测定结合实验条件对分
12、离菌株进行生理生化指标测定。应用微量发酵管对分离菌株进行生理生化指标的测定。若分离菌株能水解吐温一6 0、吐温8 0、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖和海藻糖，液化明胶，强烈水解卵磷脂，使石蕊牛乳产碱、胨化，则生理生化指标测定结果为阳性。应用微生物自动鉴定系统对分离菌株进行生理生化指标的测定。按照微生物鉴定系统规定的操作方法进行，鉴定结果为木薯细菌性萎蔫病菌，则判定该分离菌株的微生物鉴定系统的鉴定结果为阳性。7 6P C R 检测取经分离纯化的细菌菌落，配备1 1 0 8 C F U m L 的细菌悬浮液，进行P C R 检测，无需抽提总核酸。检测方法步骤见附录c。7 7 致病性测定将在L P G 培
13、养基上培养4 8h 后的菌株，配成l 1 0 8 C F U m L 的细菌悬浮液，采用针刺接种法，用消毒的接种针蘸上细菌悬浮液，针刺木薯植株的第三片、第四片叶和嫩茎等，每一菌株接种5 株，阴性对照用无菌水代替接种液。接种后的植株置放于人工气候箱，在2 8 3 2 温度下，先在1 0 0 相对湿度保湿2 4h 4 8h，然后在8 0 左右的相对湿度下，每天在70 0 01 x 1 00 0 0l x 下光照培养1 6h，黑暗下培养8h。接种7d 后开始观察症状，每天观察一次，连续观察3 0d。植株上的叶片出现黑绿色到蓝色水渍状不规则斑(直径1c m 4c m)，病斑迅速扩展并且不规则形斑沿着叶
14、脉和叶片边缘结合在一起，对着光线可看到半透明的斑，叶片感病部分周围变成亮褐色；整株植物表现出萎蔫、在茎横切面出现褐变且挤压有菌脓溢出的视为发病，表明从种子或植株或种茎上分离到的菌株具有致病性，而且需要从接种病斑上再次分离出来；不表现症状的接种植株视为不发病。8 结果判定若植株呈现典型症状，或初筛P C R 检测结果为阳性，要对可疑样品进行病菌的分离；根据分离菌株在培养基上的形态特征，确定可疑菌落，至少采用一种方法(生理生化指标测定和分子检测方法)对可疑菌落进行鉴定，最后进行寄主的致病性测定以确诊。如果一种或一种以上鉴定方法为阳性，且致病性测定表现为典型症状，则判定为检出木薯细菌性萎蔫病菌；如果
15、任一种鉴定方法都为阴性，则判定为未检3G B T2 8 0 9 6-2 01 1出木薯细菌性萎蔫病菌。9 样品和菌种保存9 1 样品保存样品(种子或植株或种茎)拍照后均应制成干标本，经登记和签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存3 个月。对鉴定为木薯细菌性萎蔫病菌的样品至少应保存6 个月，以备复检、谈判和仲裁，样品保存期满后，需经灭菌处理。9 2 菌种保存从样品中分离并鉴定为木薯细菌性萎蔫病菌的菌株应转接到试管斜面，经登记和签字后置于4 冰箱中保存，定期转接；或病菌悬浮液加6 0 甘油置于超低温冰箱(-7 0)长期保存，或用真空干燥机制成病菌冻干粉置于超低温冰箱(一7 0)长期保存。4A 1
16、地理分布附录A(资料性附录)木薯细菌性萎蔫病菌其他信息G B T2 8 0 9 6-2 0 11美洲：墨西哥、古巴、巴拿马、特立尼达和多巴哥、巴西、阿根廷、哥伦比亚、委内瑞拉、法属圭亚那、尼加拉瓜。非洲：尼日利亚、刚果金、加纳、贝宁、喀麦隆、中非共和国、马达加斯加、毛里求斯、科特迪瓦、马拉维、马里、卢旺达、南非、苏丹、坦桑尼亚、多哥、乌干达。亚洲：印度、印度尼西亚、马来西亚、泰国、日本、菲律宾及中国的局部木薯种植地区。A 2 寄主植物木薯M a n i h o te s c u l e n t a，木薯其他野生种M a p i i，M g l a z i o v i i，M p a l m a t a。人工接种寄主为大戟科的E u p h o r b i ar e p a n d a，E p u l c h e r r i m a，P e d i l a n t h u s t i t h y m a l o i d e s(D e d a le ta l，1 9 8 0)。在委内瑞拉高湿多雨地区则发现转主寄主除大戟科的(E u p h o r b i a c e a e)几个种以外，
