1、【GB 168841997】流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则 流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则 前 言 流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是由脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis，Nm)通过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行，患者以儿童为多见，流行时成年人发病亦增多。人受Nm感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者，其主要临床表现为突发性高热、头痛、呕吐、皮肤和粘膜出血点或瘀斑及颈项强直等脑膜刺激征，脑脊液呈化脓性改变。此外，Nm也可不侵犯脑脊髓膜，仅表现为败血症，病重者可呈暴发型发作。为了贯彻执行中华人民共和国传染病防治法，认真做好
2、流脑流行病学监测与控制的工作，预防此病发病大幅度回升，控制其流行，特制定本标准。本标准的附录A和B为标准的附录；附录C、D、E和F皆为提示的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准负责起草单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所；参加起草单位：北京佑安医院和北京市卫生防疫站。本标准主要起草人：胡绪敬、徐莲芝、吴贵坤。本标准委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。1 范围 本标准规定了流脑的诊断标准和处理原则。本标准适用于各级、各类医疗保健、卫生防疫机构和人员对流脑病例诊断、报告与处理。2 诊断原则 2.1 应根据流行病学资料和临床表现及实验室检验结果做出临床诊断。2
3、.2 确诊需要培养Nm或检测Nm群特异多糖抗原或Nm的DNA特异片段或检测病人急性期和恢复期血清中抗Nm特异抗体。3 诊断标准 3.1 流行病学史 在冬春季节和流行地区内，儿童患病者最为多见。有些患者在发病前 7 天有明显密切接触史。3.2 临床表现 3.2.1 突然寒战、高热、恶心、呕吐、流涕、鼻塞、咽痛、全身疼痛、头痛加重。3.2.2 面色苍白、四肢发凉、皮肤发花并有散在的小出血点、唇周及指端青紫、唇周单纯疱疹。3.2.3 烦躁不安、谵妄、昏迷或惊厥。3.2.4 皮肤、粘膜瘀点典型或融合成瘀斑，血压明显下降、脉搏细速、脉压差缩小。3.2.5 颈项强直、角弓反张、克氏征和布氏征阳性。3.2.
4、6 瞳孔大小不等、边缘不整、对光反应迟钝、眼球常凝视。3.2.7 呼吸快慢及深浅不均或呼吸暂停。3.2.8 幼儿发病多不典型，常见高热、呕吐、嗜睡外，还多见极度不安与惊厥、拒乳、尖叫、腹泻、咳嗽、双目凝视、颈项强直和布氏征阳性，其他脑膜刺激征可能缺项。前囟未闭者多见隆起，呕吐频繁而失水者也可出现囟门下陷。3.3 实验室诊断 3.3.1 血象：白细胞数显著增高，最高可达 40109/L，中性粒细胞在 8090以上。3.3.2 疑为流脑者应做腰椎穿刺检查，脑脊液(CSF)压力常增高达 1.96kPa以上；典型病例CSF的外观混浊如米汤样甚或脓样；白细胞数增多，可达每升数亿，以多形核细胞为主；蛋白质
5、显著增高，可达 15g/L；糖量常低于 2.22mmol/L，氯化物也稍降低。CSF涂片可在中性粒细胞内找到革兰氏阴性双球菌。3.3.3 从病人CSF或急性期血液分离到Nm，见附录A(标准的附录)。3.3.4 从病人急性期血清或尿或CSF中检测到Nm群特异性多糖抗原，见附录C(标准的附录)。3.3.5 检测病人恢复期血清抗体效价较急性期呈4倍或4倍以上升高，见附录B(标准的附录)。3.3.6 以PCR检测到病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，见附录D(提示的附录)。3.4 病例分类 3.4.1 疑似病例：3.1 加 3.2.1 或 3.2.2 或 3.2.3 之一项。3.4.2 临床
6、确诊病例：疑似病例加 3.2.4 或 3.2.5 或 3.2.6 或 3.2.7之一项。3.4.3 确诊病例：疑似病例或临床确诊病例加3.3.3或3.3.4或3.3.5或 3.3.6 之一项。4 处理原则 4.1 对病人早期处理，见附录E(提示的附录)。4.1.1 发现疫情及时向卫生防疫部门报告。4.1.2 就地隔离，抢救治疗，降低病死率。4.1.3 给予抗菌药物，及时控制感染。4.1.4 早期发现并及时纠正休克与弥漫性血管内凝血(DIC)。4.1.5 若早期发现颅内压增高症状，及时应用脱水疗法防治脑疝和呼吸衰竭。4.2 对易感人群的处理，见附录F(提示的附录)。4.2.1 与患者密切接触的人
7、群出现上呼吸道感染样病人，应按轻症流脑患者处理。4.2.2 根据流行病学监测结果，制定A群脑膜炎双球菌多糖菌苗预防注射的计划，在流行前期完成接种任务，免疫对象接种率应达到90以上。4.2.3 除了完成上述菌苗常规免疫任务以外，还应备有应急接种用的A群脑膜炎双球菌多糖菌苗，用于控制流脑暴发流行。4.2.4 在未免疫地区出现A群Nm引起流脑暴发流行时，除了对15 岁以下儿童，还应酌情对与病人密切接触的成人应急接种上述菌苗。4.2.5 目前在我国，若出现非A群Nm引起流脑局部暴发，应及时对病人全家以及与其毗连的邻居实 施抗菌药物预防。附录A (标准的附录)流脑病原学诊断方法 A1 病原体(脑膜炎奈瑟
8、氏菌Neissria meningitidis)分离 从疑似流脑患者采集CSF或急性期血液分离Nm。A1.1 标本的采集 A1.1.1 CSF：无菌操作，吸出CSF 2mL，立即放到无菌试管内离心(20003000r/min，30min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到 10羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于20待测)，5二氧化碳环境 37培养 2472h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。A1.1.2 血液：采取病人急性期静脉血液 6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入 4mL血液(余下的 2mL血液同上离心后吸出血
9、清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20待测)，同上述条件培养 2472h，每日进行分离培养。A1.2 接种和菌种鉴定 A1.2.1 细菌形态：Nm应为革兰氏阴性，呈卵圆形或肾形，0.8m0.6m大小。常成对排列，临近两边扁平凹陷。A1.2.2 菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5二氧化碳，37培养 24h后，其菌落直径约 1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。A1.2.3 生长及抗原特性：绝大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分解蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶
10、阳性。Nm新分离菌株具有下列主要抗原：血清群特异性荚膜多糖，主要外膜蛋白OMP(包括血清型特异的 2/3 类OMP，亚型特异的 1 类OMP以及 4 与 5 类OMP)，铁调节蛋白，脂寡糖(LOS)，H.8 脂蛋白，还有菌毛抗原等，根据群特异性荚膜多糖的结构与组成成分，Nm可分为 13 个血清群(A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z)，其中 90以上的病例是由A、B和C群Nm引起的。根据 2/3 类OMP可将B群与C群Nm分成 20 个血清型，但差不多半数菌株目前尚不能分型。在可分型菌株中，以 15、2 和 4 型，P1.2、P1.1、P1.12、P1.15及P1.16
11、 亚型多见；对于A群Nm现有 4 与 21 两个血清型，以P1.7 与P1.9 亚型多见。Nm还可以分成 13 个LOS免疫型，其中A群以L10 和L11 型多见，B群中以L3，7，9 复合型多见。Nm群特异性荚膜多糖、型和亚型的OMP及LOS等抗原成分对流脑发病与流行及其菌苗的研究均具有重要价值。附录B (标准的附录)流脑血清学诊断方法 B1 玻片凝集试验 B1.1 目的 应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。B1.2 材料 B1.2.1 待检的Nm菌株纯培养物。B1.2.2 Nm诊断血清：多价I(包含A、B、C、D群)，多价包含 1889(Y)、1890(H)、1892
12、(29E)，多价 包含 319(W135)、1916(X)、1486(I)、1811(K)群及各群单价血清，共计 14 种。B1.2.3 洁净载玻片。B1.2.4 生理盐水。B1.3 试验方法 B1.3.1 先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。B1.3.2 用白金耳刮取菌苔少许，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。B1.3.3 轻轻摇动玻片数次，在 12min内出现明显凝集者，即为阳性。B1.3.4 检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价或多价血清。若发生凝集，再用单价血清定群。从病人分离的
13、疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则送研究单位进一步鉴定。B1.3.5 在玻片上与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。B2 酶联免疫吸附试验(ELISA)B2.1 目的应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。B2.2 材料 B2.2.1 酶联免疫吸附试验检测仪。B2.2.2 聚苯乙烯板(40 孔或 96 孔)。B2.2.3 加样器(单头或 4 头或 8 头，定量为 0200L)。B2.2.4 羊抗人IgG辣根过氧化酶结合物。B2.2.5 试验质控血清(抗体阳性和阴性的人血清)。B2.2.6 菌体抗原(A、B和C群Nm
14、标准菌株)或A群Nm多糖菌苗。B2.2.7 包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液)：碳酸氢钠(NaHCO3)2.9g 碳酸钠(Na2CO3)1.6g 叠氮钠(NaN3)0.2g 加蒸馏水至 1000mL，pH9.6，置 4可备用两周。B2.2.8 洗涤液(0.5mol/L氯化钠)：氯化钠(NaCl)29.3g 吐温20(Tween20)0.5mL 加蒸馏水至 1000mL，临用前配制。B2.2.9 稀释液：氯化钠(NaCl)8.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)2.9g 氯化钾(KCl)0.2g 吐温20(Tween20)0.5mL 加蒸馏水至
15、1000mL，pH7.4，置 4备用。B2.2.10 底物缓冲液：(1)0.2mo1/L磷酸氢二钠 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)35.8g 蒸馏水 500mL (2)0.1mol/L柠檬酸 柠檬酸C3H4(OH)(COOH)3H2O 10.5g 蒸馏水 500mL (1)液和(2)液分别置 4备用。临用前按下述配方配制底物溶液，pH为 5.0：(1)液 2.57mL (2)液 2.43mL 邻苯二胺 4mg 蒸馏水 5mL 30H2O2 15L B2.2.11 填充液：稀释液 100mL 白明胶或牛血清白蛋白(Bovine Serium Albumin，BSA)0.5g B2.2.1
16、2 终止溶液：2mo1/L硫酸(H2SO4)。B2.3 试验步骤 B2.3.1 包被抗原的制备 将Nm纯培养的菌苔刮到生理盐水中，离心(3000r/min，30min)洗涤菌体 3 次，再混悬于生理盐水中，置 5630min灭活，用比浊法测定菌悬液中细菌浓度，用包被液将其稀释成 106个菌/mL作为包被抗原。对于A群Nm，亦可将A群Nm多糖菌苗稀释到 10g/mL进行包被。B2.3.2 抗原的包被 用蒸馏水把酶标板各孔冲洗干净，空干水，置 37烘干；往每孔中加包被抗原 100L，置 4C过夜；倾出孔内液体，用洗涤液冲洗各孔 3 次，每次 1min，并且均在干净的吸水纸上或纱布上拍打酶标板，空干孔内的液体。B2.3.3 填充 空干孔中液体，用 1mL吸管加填充液，每孔加以 0.25mL；置室温 30min，同上洗涤，空干孔内液体；酶标板置塑料袋中，密封贮存于 4C，可备用一个月。B2.3.4 检测待检血清 B2.3.4.1 病人急性期和恢复期血清均从此 12 开始，用稀释液连续倍比稀释到第7孔，第8孔以稀释液代替血清作为阴性对照之一；酶标板置 37培育 1h后同上洗涤。B2.3.4.2
