1、附件13食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法(KJ201913)1. 范围本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法。本标准适用玉米、小麦及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速筛选测定。第一法 比色法2. 原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（T线）与控制线（C线）颜色深浅的比较，对样品中玉米赤霉烯酮进行结果判定。3. 试剂及材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T 6682规定的二级水。3.1. 试剂3.1.1. 乙
2、腈。3.1.2. 甲醇+水（7+3，体积比）。3.1.3. 稀释缓冲液（胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置）。3.2. 参考物质玉米赤霉烯酮的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度95%。表1 玉米赤霉烯酮参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量玉米赤霉烯酮Zearalenone17924-92-4C18H22O5318.36注：或等同可溯源物质。3.3. 标准溶液的配制3.3.1. 标准储备液：称取适量标准品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成浓度为100 g/mL的标准储备液。
3、18 避光保存，有效期6个月。3.3.2. 标准工作液：准确量取标准储备液（100 g/mL）（3.3.1）100 L，置于10 mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 稀/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液，2 8 避光保存，有效期1个月。3.4. 材料玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为玉米、小麦及其碾磨加工品。4. 仪器和设备4.1. 移液器：100 L、200 L、1 mL和5 mL。4.2. 旋涡混合器。4.3. 离心机。4.4. 电子天平：感量为0.01 g。5. 环境条件环境温度：20 30 。空气相对湿度：最佳测定湿度45 %65 %。若湿度低于45
4、 %，相应延长待测液-试纸条反应时间，以质控实验为准；若湿度为65 %80 %，微孔与试纸条拆开后立即使用，避免微孔与试纸条长时间暴露在空气中受潮；避免在湿度80 %以上湿度进行实验。6. 分析步骤6.1. 试样制备按GB 5491扦取的样品充分碾磨或粉碎混匀，过40目筛。6.2. 提取准确称取试样5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL 甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。准确移取0.8 mL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5 mL离心管中，加入25 L上清液，混匀，待检。6.3. 测定步骤依检验所需，取相应数量的
5、金标微孔和试纸条，做好标记。吸取待检液200 L于金标微孔中，抽吸至孔底的紫红色颗粒完全溶解，孵育10 min。将试纸条插入金标微孔中，反应3 min5 min。从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色情况，进行结果判定。（若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验环境温度。）7. 质控试验每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。7.1. 空白试验7.1.1. 试剂空白试验：除不称取试样外，均按6.2和6.3所述步骤操作。7.1.2. 基质空白试验：准确称取空白试样，按6.2和6.3所述步骤操作。7.2. 阳性质控试验准确称取玉米赤霉烯酮含量
6、为60 g/kg的质控样，按6.2和6.3步骤操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60 g/kg，按6.2和6.3步骤操作。8. 结果判定通过对比控制C线和检测T线的颜色深浅进行结果判定。8.1. 无效结果无论样品中有无玉米赤霉烯酮存在，控制C线均会出现一条紫红色条带。若C线未显色，表明操作不正确或试纸条已失效，检测结果无效（见图1）。无效图1 试纸条目视判定图8.2. 阳性结果控制C线显色，检测T线显色比C线浅或者没有颜色，判定为阳性（见图2）。8.3. 阴性结果控制C线显色，检测T线显色比C线深或者一致，判定为阴性（见图2）。
7、比色法图2 试纸条目视判定图8.4. 质控试验要求空白试验结果应为阴性，阳性质控试验结果应为阳性。第二法 消线法9. 原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过T线显色与否进行结果判定。10. 试剂及材料同3。11. 仪器和设备同4。12. 环境条件环境温度：10 40 。空气相对湿度：同5。13. 分析步骤13.1. 试样制备同6.1。13.2. 提取准确称取试样5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入12.5 mL甲醇+水溶液（3.1.2），
8、用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。准确移取400 L稀释缓冲液（3.1.3）于1.5 mL离心管中，加入上清液(小麦50 L，玉米80 L），混匀，待测。13.3. 测定步骤同6.3。14. 质控试验每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。14.1. 空白试验14.1.1. 试剂空白试验：除不称取试样外，均按13.2和13.3所述步骤操作。14.1.2. 基质空白试验：准确称取空白试样，按13.2和13.3所述步骤操作。14.2. 阳性质控试验准确称取玉米赤霉烯酮含量为60 g/kg的质控样，按13.2和13.3步骤操作。或准
9、确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60 g/kg，按13.2和13.3步骤操作。15. 结果判定通过观察检测T线显色与否进行结果判定。15.1. 无效同8.115.2. 阳性结果控制C线显色，检测T线不显色，判定为阳性（见图3）。15.3. 阴性结果控制C线显色，检测T线显色，判定为阴性（见图3）。消线法图3 试纸条目视判定图16. 质控试验要求同8.4第三法 读数仪法17. 具体检测步骤及结果判定可参考相应的说明书操作，质控试验参照第一法与第二法。18. 结论本方法筛查出的阳性样品进行确认时，应按GB 2761指定方法标准检测并判定。1
10、9. 性能指标19.1. 检出限60 g/kg。19.2. 灵敏度灵敏度95%。19.3. 特异性特异性90%。19.4. 假阴性假阴性5%。19.5. 假阳性假阳性10%。注：性能指标计算方法见附录A。20. 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。本方法参比标准为GB 5009.209-2016 食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定。附录A快速检测方法性能指标计算表样品情况a检测结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N
11、21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异（c2）c2=（N12-N21-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a样品中实际的公议值结果；b由玉米赤霉烯酮胶体金试纸条检验方法得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法起草单位：成都市食品药品检验研究院。本方法参与单位：江南大学、国家粮食局科学研究院、广东省食品检验所、山东省食品药品检验研究院、浙江省食品药品检验研究院。本方法主要起草人：肖全伟、姚蕾珺、王昕、张敏、胥传来、田洪芸、沈泓、周露
