1、DB/T 辽宁省质量技术监督局 发布2009-01-01实施2008-12-05发布辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程（Liaoning cashmere goat straw frozen semen manufacture regulations）DB21/T 16972008DB21辽宁省地方标准ICS备案号：1DB21/T 16972008目 次前 言II1 范围32 规范性引用文件33 术语和定义34 规格与质量标准35 制作程序36 解冻47 检查48 包装49 保存和取用410 容器清洗411 细管冻精运输4II前 言本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出并归口。 本标准由辽宁省辽宁绒
2、山羊育种中心、辽宁省畜牧科学研究院负责起草。本标准的主要起草人：刘兴伟、韩迪、豆兴堂、王世权、刘庆权。辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程1范围本规程规定了辽宁绒山羊细管冷冻精液的技术要求、制作程序、解冻、检验、标记、包装、存放、取用、运输及容器清洗等方法。本规程适用于辽宁绒山羊，其他品种绒山羊可参照本规程。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。GB 5458 液氮生物容器GB/T 1.1-1993标准化工作导则3术语和定义下列术语和定义
3、适用于本标准。精子密度：1ml精液中的精子数。有效精子数：有效精子数=精液量密度活力。精子活力：37环境下直线运动精子数占总精子数的百分率。精子顶体完整率：顶体完整精子数占总精子数的百分率。精子畸形率：畸形精子数占总精子数的百分率。精子存活率：在37环境下保存4h时直线运动精子数占总精子数的百分率。细菌数：一剂量冻精解冻后经培养所长出的菌落数。4规格与质量标准4.1规格 0.25ml剂型。4.2质量标准4.2.1精子活力30%。4.2.2每剂细管冻精有效精子数1500万个。4.2.3精子畸形率20%。4.2.4精子顶体完整率50%。4.2.5细菌数1000个。4.2.6解冻后的精子存活时间 在
4、58条件下精子保持30%活力的时间12h；在37条件下精子保持30%活力的时间4.5h。4.2.7标识 在冻精细管上,打印品种、羊号、生产日期。4.2.8灌装后必须封口严密,在解冻时不能进水，同时在细管冻精的前端留约0.8cm的空隙。5制作程序5.1采精种公羊的标准 种公羊的体型外貌和生产性能均应符合一级以上种羊标准。种公羊必须体质健壮，无下列传染病：布鲁氏杆菌病、副结核病、口蹄疫、蓝舌病、及其它隐性遗传缺陷性疾病。5.2采精方法 应用假阴道法进行采精，采精前分别用温水和灭菌生理盐水清洗公羊阴茎和包皮。5.3原精质量标准 颜色为乳白色或淡黄色,精子密度15107/ml,活力60%,畸形率10%
5、。5.4精液的稀释5.4.1器具卫生 所用器具，保证清洁、无菌、无消毒剂残留。5.4.2稀释保护剂的配制 配制冻精用的稀释保护剂，必须用新鲜的双重蒸馏水、卵黄或在保质期内的无动物来源精子细胞膜保护剂，其它药品为分析纯化学试剂。如使用成品稀释液,则应选择国家认定的标准稀释液生产厂家生产的细管冻精稀释液。 5.5降温和平衡 稀释后的精液，经11.5h逐渐降温到45，然后在此温度下平衡24h。5.6冷冻 将平衡后的细管精液移至955的低温环境中,冷冻3min，然后浸入液氮中。6解冻将液氮中的细管冻精取出,立即浸没于3840的温水中,轻轻摆动约20s取出,用干净纱布擦干。7检查每只种羊的细管冻精抽检1
6、2剂。保存的细管冻精,每6个月抽检一次,每次抽检35剂。7.1解冻活力检查 细管冻精解冻后，分别在细管上、中、下部分别取精液少许置于显微镜下观察35个视野，目测视野中呈直线运动的精子数占总精子数的比例，估测出平均活力。7.2有效精子数测定 在采集原精后,用分光光度仪、红细胞计数板或精子密度检测仪测出原精的精子密度,再根据稀释倍数,计算出稀释后的精子密度,再根据解冻后的细管冻精活力计算出每剂细管冻精的有效精子数。7.3顶体完整率和畸形率测定 用姬姆萨染色法或1000倍的带光栅的相差显微镜观测细管冻精的顶体完整率和畸形率，每个样品观察精子总数500个。7.4解冻后存活时间测定 取同一位置的细管冻精
7、10只,同时浸入3840的温水中，待解冻后同时置于37恒温水浴锅中，先测定第一剂细管冻精的活力,然后每隔0.5h,观测第二剂细管冻精的活力,依此类推,直到水中的细管冻精的精子全部死亡或活力降到30%为止,从而得到至精子全部死亡时的存活时间和解冻活力降至30%时的存活时间。7.5细菌数检查 取0.20ml解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在37恒温箱中培养24h，统计出现的菌落数。8包装0.25ml细管冻精采用指形管包装,每个指形管中装有合格细管冻精25剂,每8个指形管包装于一个布袋内。9保存和取用9.1保存 检查合格的细管冻精贮存于装有液氮的生物容器内,定期添加液氮,使细管冻精始终浸没于液氮中。在每个包装袋上注明种羊羊号、解冻后活力和数量。9.2取用 取细管冻精时,将冻精袋提升到液氮罐颈口下约10cm处,用长镊子迅速将细管冻精取出进行解冻,操作时间10s,需继续取出细管冻精,则将冻精包装袋浸入液氮中,再重复以上操作,取出的细管冻精停留在空气中的时间5s。10容器清洗液氮生物容器，应在使用前后彻底检查和清洗。清理时，先用中性洗涤剂刷洗，再用4045温水冲洗干净，在室温下放置48h以上再充入液氮。长期贮存冻精的容器，应定期清洗。11细管冻精运输必须使用合格的超低温生物运输容器进行运输。2
