1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 6 1-2 0 0 2衣原体感染检测方法补体结合试验P r o t o c o l o f c o mp l e me n t f i x a t i o n-T e s t f o r c h l a my d i a i n f e c t i o n2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 0 0 3 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国家 质 量 监 督 检 验 检疫 总 局发 布S N/T 1 1 6 1-2 0 0 2前言本标准的附录 A、附录B,附录C、附录 D,附录E均为规范性附录。本标准由国家认证认可监
2、督管理委员会提出并归口。本标准起草单位;中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:徐涤平、黄晨、刘泽文、陈平、段正赢、颜小平、陈建军、杨宜生，s x/T 1 1 6 1-2 0 0 2衣原体感染检测方法补体结合试验范围 本标准规定的补体结合试验(C F)包括直接补体结合试验(D i r e c t C o m p l e m e n t F i x a t i o n T e s t,D C F)和间接补体结合试验(I n d ir e c t C o m p l e m e n t F i x a t i o n T e s t,I C F),D
3、C F适用于猪以外的哺乳动物和鹦鹉、鸽(三年龄以上老鸽除外)、火鸡衣原体病的检疫和诊断。I C F 适用于其他禽鸟和猪衣 原体病的 检疫和诊断。2 材 料准备2.12.2录 A,2.3一次。2.42.52.6器材:1 2 t o r n X 3 7 mm.试管、试管架、水浴箱、U型微量反应板(8 X1 2 孔)。补体:由官方认可单位供应，按说明书使用和保存。试验前须对补体进行效价滴定。滴定方法见附溶血素:由官方认可单位供应。试验前须对溶血素进行效价滴定，以后每隔2 个一3 个月测定效价滴定方法见附录B e1 0 0 绵羊红细胞悬液:制备方法见附录C,敏化红细胞:制备及使用方法见附录A,被检血清
4、:按常规方法采血，分离血清，要求不溶血、无腐败，在血清中加人。0 1%硫柳汞或。.I%叠氮钠防腐，试验前需灭能。不同动物血清灭能的温度和时间见附录D.了 抗原和标准阳性血清、指示血清、阴性血清:由官方认可单位供应，按说明书使用。抗原和阳性血清效价滴定的方法见附录E,3操作方法3.1 直接补体结合试验3.1.1 试管法 按表I的程序操作。试验要同时设抗补体对照、阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、溶血素对照和生理盐水对照。表 飞 直接补体结合试验 试管法)单位为毫升s N/T 1 1 6 1-2 0 0 2表 1(续)单 位 为毫 升成 分被检血清各 项 对 照试 验 管抗补体 对 照阳 性血
5、 清阴性血 清抗 原对 照溶血 索生 理盐 水效价I:41:81+1 61:321:6 41:1 2 8l:42工 作 量1-42 工作量混匀，4 C 1 6 h-1 8 h 感作，取出后 3 7 C水浴3 0 min敏 化红 细 胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2混匀，3 7 C 水浴 3 0 m i n结 果到 足#十+#1 3 2全不落全不 落25落5 0%落7 5%溶全 溶全 溶全不 I ff全溶全 溶全 溶全不 洛3.1.2 微量法:用U型8 x1 2 孔微量反应板。按表 2 的程序操作。试验同时设抗补体对照、阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对
6、照、溶血素对照和生理盐水对照。表 2 直接补体结合试验(微最法)单位为微升成分被 检 血 清各 项 对 照试 验 孔抗补体 对 照阳性血 清阴 性血 清抗 原对 照溶血 索生 理盐 水效 价1:41+81:1 61:3 21 16 41+1 2 81:41:42 工 作 量2上 作 量血 清2 52 52 52 5一2 52 52 52 52 52工 作 量 抗 原2 52 52 52 52 52 52 52 52 52*u.补 体5 05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 0生 理盐 水2 52 55 01 0 0拿 昆 匀，4 C 1 6 h-1 8 h感J作，取 出后
7、 3 7 水 洲f i 3 0 m i n敏 化红 细 胞5 05 05 05 05 05 050 50 S O5 0馄匀，3 7 C水浴 3 0 mi n结 果判 定#+十十+十洋#I，3 2全不 洛全不 榕2 5%洛5 0%落7 5溶全 溶全 溶全不洛全溶全 溶全 溶全不 落3.2 间接补体结合试验3.2.1 试管法:按表 3的程序操作。表 3间接补体结合试 验(试管法)单 位 为 毫 升成 分被检 血清抗 补 体 对 照间接补反对照直 接 补反 对 照抗 原对 照效 价试验 管阳 性血 清阴 性血 清指 示 血 清1;41:81:1 61:3 21:6 4I:1 2 8I:41 工 作
8、量1:41 工 作 量血 清0.飞0.10.10.10.10 10.10.I0.11 工 作 量 抗 原0.10.10.1o.1o.10.10-1o.Io.1o.1S NI T 1 1 6 1-2 0 0 2表 3(续)单 位 为 毫 升成 分被检血清抗补体 对 照间接补反对照直 接 丝反 对 照抗 原对 照效 价阳 性血 清阴性血清指 示 血 清试 验 管1:41:81:1 61:3 21:6 41:1 2 81:41 工作量1:41 工 作 量混匀，4 Ch-S h感作1 工作量指 示 血 清0.10.10.10.10.10.10.10.10.12 单 位补 体0.20.20.20.20.
9、20.20.20.20.20.20.2生 理 盐 水0.20.10.2混匀，4 C过夜或8h 1 0 h，取出后3 7 C水浴 3 0 mi n敏 化红 细 胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2混匀，3 7 C水浴 3 0 mi n判 定十十+十+#耸#11，1 6(+十)判为阳性。(1:8(+)判为阴性。=1:1 6(+)判为可疑;重复试验仍为可疑，则判为阳性。牛、绵羊、山羊、鸽、火鸡、鹦鹉等被检血清效价:)l:8(+)判为阳性。1，4(-I-)判为阴性。)1:4(+十)判为可疑;重复试验仍为可疑，则判为阳性。)1:6 4(+)表明现正在或近期感染过衣原体。间
10、接补体 结合试验结果判定:最 后一次3 7 水浴3 0 m i n 后，立即判定。1 质控判定对照试验为如下结果时试验方可成立，否则应重复试验。被检血清抗补体对照:完全溶血(一)。阳性血清加抗原加指示血清:完全溶血(一)。阴性血清加抗原加指示血清:完全抑制溶血(#)。抗原抗补体对照:完全溶血(一)。2 判定标准鸭被检血清效价:)1:1 6(+)判为阳性。_1:8(+)判为阳性。(1，4(+)判为阴性。=1:8(+十+)或 1:4(一)判为可疑;重检仍为可疑判为阳性。)1:6 4(+)表明现正在或近期感染过衣原体。s x/T 1 1 6 1-2 0 0 2 附录A(规范性附录)丰 卜 体效价滴定
11、A.1 补体效价的测定用生理盐水将补体做1:6 0 稀释，按表A.1 测定补体效价。表 A.1 补体效价滴定单 位 为 毫 升组 别抗 原生理 盐 水试 管 号123456712345672 单 位 抗 原0.10.10.10.10.10.10.1生理 盐 水0.2 70.2 50.2 20.2 00.1 80.1 60.1 40.3 70.3 50.3 20.3 00.2 80.2 60.2 41:6 0补体0.0 30.0 50.0 80.1 00.1 20.1 40.1 60.0 30.0 50.0 80.1 00.1 20.1 40.1 6混匀，3 7 水浴3 0 min敏 化 红 细
12、胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2混匀，3 7 C水浴 3 0 min结 果 示 例#L .+#1 二+.万一厂全 不 溶 2 5%溶 5 0%溶 7 5 纬 溶全 溶全 溶全 溶2、刁 丁 刃 弓 叮2 5%溶 5 0溶 7 5%溶全 溶全溶全 溶土中嘴注 敏化红细胞系由1%公绵羊红细胞悬液加等量的2 个工作单位的溶血素放 3 7 水浴1 5 m i n后再滴加.A.2 补体效价的计算 能使红细胞完全溶血的补体量即为1 个补体单位，表 A.1 所示第 5 管。.1 2 ml为一个补体单位。而正式试验使用两个补体单位，原补体在使用时应稀释的倍
13、数按式(A.1)计算:九原补体应稀释倍 数=使用时每管加人量 X滴定时补体稀释倍数0.2 X 6 00.1 2 X 2 一个单位量 XZ=S O(倍)s N/T 1 1 6 1-2 0 0 2 附录B (规范性 附录)溶血素效价滴定 先将溶血素 1:1 0 0 稀释(含5 0%甘油的溶血素0.2 m l加生理盐水 9.8 m l)，按表 B.1 稀释成不同倍数，再按表 B2 操作。表B.1 溶血素稀释单 位 为 毫 升成 分管号123456789稀 释 倍 数1 0 0 02 0 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 08 0 0 09 0 0 0生 理 盐
14、 水9123456781:1 0 0溶血素11:1 0 0 0 溶血素111I1111表 B.2 溶血素效价测定单 位 为 毫 升成分管 号123456789对 照稀 释倍 数1 0 0 02 0 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 08 0 0 09 0 0 0补 体1-100v 16t1%红 细 胞稀 释 溶 血 素0.10.10.10.10.10.10.10.10.100.10生 理 盐 水0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.30.20.51:6 0 补体0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.201%红
15、 细 胞0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1充分摇匀，3 7 C水浴3 0 m i n结 果+#全 溶全 溶全 溶全 溶全 溶全 溶全 溶7 5溶5 0%溶全 不 溶全 溶全 不 溶注:以完全溶血的溶血素最高稀释倍数为一个溶血单位，表 B.2 所示为7 0 0 0倍，正式试验时，使用两个溶血素单 位 本例为 3 5 0 0倍s x/T 1 1 6 1-2 0 0 2 附录C (规范性附录)%绵羊红细胞悬液的制备 采取成年健康公绵羊血液，用玻璃珠脱纤后，按1，1 加人红细胞保存液，混匀后分装成5 m L-1 0 mL-瓶，封固后放 4 冰箱可保存2个月，用前用
16、生理盐水洗涤 3次，最后一次在 3 0 0 0 r/min离心2 0 mi n，按红细胞泥容量加生理盐水配成 1 写红细胞悬液。红细胞保存液配方:葡萄糖 2 0.5 g,氯化钠4.2 g，柠檬酸三钠8 g，柠檬酸0.5 5 g,蒸馏水加至1 0 0 0 m L,5 6 k P a 2 0 mi n灭菌，备用。附录D (规范性附录)各种畜禽血清灭能温度和时间不同畜禽血清灭能温度和时间见表D.1 a 表 D门不同畜禽血清灭能温度和时间动物种类灭能温度/C灭能时问/m i n鸡5 63 5豚鼠、火鸡、鸭、鸽、鹅、鹦鹉、鹤鹑、猪5 63 0黄 牛56-5 73 0水牛、山羊(1:2 稀释)6 23 0马、兔(1，2 稀释)6 53 0绵羊5 8-5 93 0骡、驴(1:2 稀释)6 2-6 43 0骆 驼5 43 0 附录E (规范性附录)抗原、阳性血清效价滴定方法E 门测定抗原、阳性血清效价程序 测定抗原、阳性血清效价按如下程序进行:E.1.1 取8。支试管，排成纵横各 9 排的方阵(第 9 排缺 1 管)。E.1.2 抗原和阳性血清分别从 1:8 1:5 1 2 做倍比稀释，阴性血清做 1
