1、S目中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 2 2 8-2 0 0 3国 境 口岸 艾 滋 病 检 验 规 程E x a m i n a t io n c o d e s f o r H I V/A I D S a t f r o n t i e r p o r t2 0 0 3-0 8-1 8 发布2 0 0 4-0 2-0 1 实施中华人民共和国*太国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局.s N/T 1 2 2 8-2 0 0 3目次前言 .。，一m1 范围，.”，4 一1z 规范性引用文件 。一13 术语和定义 ，.，14 检验对象 .15 检验程序 。，。16 检验报
2、告 *，1 ，二 ，价 2附录A(资料性附录)HI V抗体的检测原理和方法 ，。，。，。，一 3附 录$(规 范 性 附 录)H I V 抗 体 实 验 流 程图 一”。二 .。一 二 二7附录C(资料性附录)HI V抗原的检测原理和方法，.，4 一 8附录D(资料性附录)H I V核酸的检测原理和方法 。一 9附 录E(资 料 性 附录)H I V-1 的 分 离 培 养，二 ，”卜，一 1 1附录F(规范性附录)HI V抗体初筛阳性送检化验单式样 。1 2附录G(规范性附录)H I V抗体检测确认报告式样 。1 3S N/T 1 2 2 8-2 0 0 3前言 本标准的附录B、附录 F、附
3、录G为规范性附录，附录 A、附录 C、附录 D,附录 E为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国广东出人境检验检疫局负责起草，中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局参加起草。本标准主要起草人:沈镜生、李华、罗小光、姜鹤、朱虹.本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 2 2 8-2 0 0 3国 境 口 岸 艾 滋 病 检 验 规 程范围本标准规定了国境口岸艾滋病的检验对象、检验程序及检验报告。本标准适用于国境口岸艾滋病检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引
4、用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 1 6 0 0 0-1 9 9 5 HI V/AI D S诊断标准及处理原则 S N/T 1 2 7 9 人出境特殊物品处理规程 S N/T 1 2 2 9 国境口岸艾滋病监测规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。人英免班缺陷病番h u ma n i m mu n o d e f i c i e n c y v ir u s(H I V)引起艾滋病的病原体，目前发现有HI V-1 和 H I V-
5、2 型。艾滋擂a c q u i r e d i mmu n o d e f i c i e n c y s y n d r o me(AI D S)由人类免疫缺陷病毒引起的获得性免疫缺陷综合征.3.3特殊物品s p e c i a l p r o d u c t s可造成艾滋病传播的一类物品。包括:微生物、人体组织、器官、血液及血液制品、生物制品。4检验对象4.14.24.3人出境人员及其他申请接受检验的人员。人出境特殊物品.疑似 A I D S病人和 HI V感染者的尸体、骸骨。5检验程序5.1 标本的采集、运送 遵照 S N/T 1 2 2 9和 S N/T 1 2 7 9的要求进行。5
6、.2 样品的处理5.2.1 样品的核查5.2.1.1 核实 化验单或送检 单与 样品 相符。5.2.1.2 记录样品容器有无破损，溢漏情况。5.2.1.3 如有溢漏，应立即将尚存的样品移出，并对样品容器消毒。S N/T 1 2 2 8-2 0 0 35.2.1.4 检查并记录样品的质量，如有无严重溶血、细菌污染、血脂过多以及黄疽等情况.52，2血液5.2.2.1将血液先自 然存放1 h -2 h 后，再3 0 0 0 r/m i n,离心1 5 m i n,5.2.2.2 吸取上清液进行检测或吸出上清液于冻存管中，再进行检测.5.2.2.3 样品如要储存，则应在室温下4h内分离血浆.52.24
7、 离心后的样品如在三天内检测，可放 2 8 冰箱中。5.2.2.5 短期内储存可在一2 0 以下保存，长期储存，则应在一7 0 以下保存。523 特 殊物品 应先将各类特殊物品进行适当处理，如用生理盐水、去离子水等进行溶解、稀释，以便能用常规诊断试剂进行检测。5.2.4 疑似 AI D S病人和 HI V感染者的尸体、骸骨5.2.4.1 尽可能采集尸体或骸骨中尚存血液或其他体液，如尿液等，采集方法见 S N/T 1 2 2 9,5之4.2 对采集的样品处理方法参见 5.22 和52.3.53实验室检测5.3.1 H I V抗体初筛试验5.3.1.1 样品验收合格后，用符合规定的初筛检测试剂进行
8、检测。5.3.1.2 初筛检测结果呈阳性反应的标本，应进行复检。53 1.3 复检时应用两种不同原理的初筛检测试剂。5.3.1.4 复检如均呈阳性反应，或有一种试剂为阳性 该标本需送上级实验室复检或确认。5.31.5 送检时应重新采集该受检者血液标本和原有血液标本一并送检口5.3.1.6 初筛试验的方法参见附录 A,5.3.1.7 初筛试验流程图遵照附录 B的规定。5.3.2 H I V抗体确认试验5.3.2.1 核对送检标本和送检单，确认无误后，方可进行 HI V抗体确认试验。5.3.2.2 将复检呈阳性反应的标本用免疫印迹法 HI VI/2 混合型试剂进行确认试验。5.32.3 确认试验流
9、程图遵照附录 B的规定。5.3.2.4 确认试验结果的判定遵照 G B 1 6 0 0 0-1 9 9 5 中的规定。5.3.3 H I V抗原的检测 参见附录C,5.3.4 H I V核酸的检测 参见附录D,5.3.5 H I V病毒分离 参见附录E。检验报告6，Hl v抗体初筛检测报告6.1.1 初筛检测阴性结果应标注实验方法并填记“阴性”。6.1.2 初筛检测中发现 H I V抗体阳性反应的，遵照 5.3.1.2 至 5.3.1.7 规定。6.1.3 不得向受检者宣布初筛检测阳性结果。6.1.4 送检单遵照附录F的规定。6.2 HI V抗体确认检测报告621 确认试验结果阴性的，由一名高
10、级卫生技术职称人员核签后向送检单位出具确认报告.6.2.2 确认试验结果阳 性的，应遵照附录G的规定 填写确认报告。2S N/T 1 2 2 8-2 0 0 3 附录A (资料性 附录)H I V抗体的检测原理和方法A.1 H I V抗体初筛试验A.1.1 酶联免疫吸附试验(E L I S A)A.1.1.1 间接酶联免疫吸附试验A.1.1.1.1 原理:反应孔包被 HI V抗原+样品+酶标抗人球蛋白+底物.A.1.1.1.2 结果说明:样品中有 H I V抗体者显明确颜色，无色则无 HI V抗体。A.1.1.2 竞争酶联免疫吸附试验A.1.1.2.1 原理:反应孔包被 H I V抗原+样品+
11、酶标 HI V抗体十底物。A.1.1.2.2 结果说明:样品中有 HI V抗体者无色或淡色，显明确的颜色则无HI V抗体。A.1.1.3 抗原夹心酶联免疫吸附试验A.1.1.3.，原理:反应孔包被 HI V抗原十样品+酶标抗原+底物.A.1.1.3.2 结果说明:样品中有 HI V抗体者显明确颜色，无色则无 H I V抗体A.1.1.3.3 方法举例A.1.1.3.3.1 试剂配制 洗液:用蒸馏水或去离子水 I，2 5稀释浓缩磷酸缓冲液，配制好的洗液在 2 0C 8 可保存 两周;-T MB底物:根据试验孔的数量将T MB底物与脉过氧化物(u r e a p e r o x i d e)溶液等
12、量混合，配制 后的底物避光储存，在室温(1 8 0C -2 5 0C)可保存 6 h,TMB底物和脉过氧化物要避免与金属 和金属器皿接触;终止液:取5 0 m L浓硫酸(1 8 mo l/L)加 8 5 0 m L蒸馏水配制成浓度为 1 mo l/L的硫酸。A.1.1.3.3.2 洗板程序 每孔加洗液 3 0 0 p L，避免洗液溢出，洗液于孔中停留3 0 s-6 0 s，然后将洗液吸干;重复五 次;最后一次吸出之后，通过在吸水纸上拍打，将残留在孔底及孔壁上的磷酸缓冲液除去。A.1.1.3.3.3 试验步骤 取出所需酶标条，揭开封条，孔内的珠子为冻干的抗原酶结合物球，注意使其保留于孔内;每孔加
13、 1 0 0 I.L标本稀释液，包括对照孔;加5 0 p L标本或对照血清到各试验孔。每板设三孔阴性对照，两孔阳性对照;振荡(微量振荡器 9 0 0 r/m i n)1 5 s;3 7 士2 0 C孵育 6 0 mi n 士5 mi n;用磷酸缓冲液洗六次，见洗板程序;将试验板倒扣，把水吸干后，每孔加 1 0 0 1,L T MB底物，不要混合或振荡，废弃过剩的底物;-1 8 0C B5 0C孵育3 0 m i n 士2 min避光;每孔加 1 0 0 K L I m o l/L硫酸终止反应，充分混匀，在2h内检测;在波长4 5 0 n m士5 n m(单波长)或 4 5 0 n m土5 n
14、m和6 2 0 n m-7 0 0 n m参照波长(双波长)测每 孔的吸光度值(A),A.1.1.3.3.4 结果计算 a)N C表示阴性对照A值;P C 1 表示抗一 HI V-1 阳性质控对照 A值;P C 2表示抗一 HI V-2阳性质控S N/T 1 2 2 8-2 0 0 3 对照 A值;b)N C 应小于0.2 5 0，去掉大于0.2 5 0 的阴性 质控对照;留下的阴性质 控对照 计算平均值N C,;每 个N C 值应在0.6 N C 二 和1.4 N C、之间，去掉不符合的N C值;如果去掉任何N C 值应重新计 算 N C x;。)满足下列条件实验结果有效:1)半数以上的阴性
15、质控对照符合要求;2)P C l-N C 二 大于 0.4 0 0;3)P C 2-N C 二 大于 0.4 0 0(如果使用);4)临界值(c u t o f f)计算:1洁界值二N C,+O.1 0 0,A.1.1.3.3.5 结果的判定:样品的A值)临界值判为阳性;样品的A值临界值判为阴性。A.1.2 颗粒凝集法(P a r t i c l e a g g l u t i n a t io n t e s t)A.1.2.1原理 将 HI V抗原吸附于载体上，吸附于载体上的抗原.如与相应抗体发生结合产生凝集称为颗粒凝集。大多数凝集试验可由肉眼观察结果。A.1.2.2 试验程序 每份样品三
16、孔，在第一孔加 7 5 p L血清稀释液，第二孔和第三孔加 2 5 K L血清稀释液;取 2 5川_ 样品至第一孔，混匀，从中取2 5 E.L样品至第二孔，混匀，作倍比稀释;同样，从第二孔取 2 5川 样品至第三孔，混匀，从第三孔吸出2 5 p L弃去;向每个第二孔加人一滴(2 5可)溶解的非敏感颗粒液，向每个第三孔加人一滴(2 5 V L)溶解的 敏感颗粒液;轻轻敲打几下微量板混匀各孔内容物或在振荡器上振荡 1 mi n，加盖，室温放置 2 h,A.1.2.3 观察结果 颗粒在孔中间凝聚成圆形小块且外缘光滑的孔为阴性反应(一);颗粒在孔中凝聚成致密环状且外缘光滑的孔为可疑反应(士);孔内有清晰的宽环且外缘粗糙者，为阳性反应(十);孔内凝聚颗粒形成均一的膜覆盖在整个孔底者为强阳性反应(+);子 L 内样品与非敏感和敏感颗粒均产生凝集者，为非特异反应。A.1.3 胶体金法A.1.3.1 原理 胶体金法检测抗 HI V抗体是一种不需要任何仪器设备的血清/血浆检测法，它利用抗体抗原反应及免疫层析技术来定性检测血清/血浆中是否含有 HI V抗体。A.1.3.2 测试步骤 a)去掉每个测试条的外
