1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 3 7 9.1-2 0 0 4猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验P r o t o c o l o f t h e e n z y m e-l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y u s i n g mo n o c l o n a l a n t i b o d yf o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t c l a s s i c a l s w i n e f e v e r v i r u
2、 s2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 3 7 9.1-2 0 0 4月 臼吕本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国广东出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:许如苏、郭奕亮、肖德雄。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 3 7 9.1-2 0 0 4猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验范 围本标准规定了单克隆抗体酶联免疫吸附试验(间接法)检测猪瘟抗体的方法。本标准适用于猪瘟的检疫、诊断和疫苗免疫监测。
3、仪器设备2.5酶标板。可调移液器。恒温培养箱。电子天平:感量0.0 0 1 g,酶标检测仪。，.乃乙勺J三且 朽今2，J夕试荆31 诊断试剂3.1.1 猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原。3.1.2 猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原.3.1.3 标准阴性血清。3.1.4 标准阳性血清。3.!.5 酶标二抗(兔抗猪!g G辣根过氧化物酶结合物)。3.2 被检血清:无溶血、无污染。3.3 溶 液3.3.1 试验所需溶液包括:包被液(p H 9.6 碳酸盐缓冲液);磷酸缓冲盐水(P B S);磷酸缓冲盐水一 吐温(P B S-T)洗涤液;稀释液(P B S-T-B S);邻 苯二胺(O P D)底物液:使用前配制;终
4、止液(2 m o t/L H,S O,).3.3.2 溶液配制见附录 A a 注:诊断试剂由中国兽药监察所生产。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如 果有其他等效产品，则可按其使用说明书使用操作方法4.1 包被 用包被液将猪瘟病毒(强毒或弱毒)单抗纯化酶联抗原作1 0 0 倍稀释，每孔加人1 0 0 川 _，置湿 盒于4 0C过夜。4.2洗板 弃去孔内液体，用洗涤液洗板三次，每次 3 mi n-5 面n，甩干孔内残液，于滤纸上拍打吸干。S N 丫T 1 3 7 9.1-2 0 0 443 加被检血清和标准血清 用稀释液将待检血清作 4 0 0 倍稀释，每孔加 1 0
5、 0 I L。同时将标准阴性、阳性血清分别作 1 0 0倍稀释作对照，3 7 培育1.5 h-2 h,4.4洗板 重复 4.2。4.5 加酶标二抗 用稀释液将兔抗猪 坛G-辣根过氧化物酶结合物稀释至工作浓度，每孔加人 1 0 0 p L,3 7 培育1.5 h-2 h.4.6 洗板 重复 42。4.7 加O P D底物溶液 每孔加人底物溶液 1 0 0 L，室温下避光反应 5 mi n-1 5 mi n.4.8 终止反应 当标准阳性血清对照孔呈黄色，标准阴性血清对照孔无色或略微显色时，每孔加人5 0 p L终止液终止反应，5 mi n内测定光密度。4.9 测定光密度 以标准阴性血清对照孔作空白
6、调零，于酶标仪上测定4 9 0 n m波长的光密度(O D),5判定标 准5.1 在猪瘟弱毒酶联板上，标准阳性血清对照孔 O 1)大于等于 0.2时，试验成立，按以下标准判定结果:O D大于等于。.2，为猪瘟弱毒抗体阳性;O L 小于。.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。a)切5.2 在猪瘟强毒酶联板上，标准阳性血清对照孔 O D大于等于。.5 时，试验成立，按以下标准判定结果:a)O D大于等于 0.5，为猪瘟强毒抗体阳性;b)O D小于。.5，为猪瘟强毒抗体阴性。S N/T 1 3 7 9.1-2 0 0 4 附录A (规 范性 附录)溶液配制A.1 包被液(p H 9.6 碳酸盐缓冲液)碳酸钠(N
7、a,C O,)1.5 9 g,碳酸氢钠(N a H C 0,)2.9 3 g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至 1 0 0 0 mL,A.2 磷酸缓冲盐水(P B S)磷酸氢二钠(Na 2 HP 0,)2.1 3 g,磷酸二氢钾(KH 2 P O,)0.2 g,氯化钠(N a C ll8.0 g,抓化钾(K C D0.2 g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1 0 0 0 m L,p H应为7.4，否则，须用3 m o l/L 氢氧化钠调p H为 7.4,A.3 磷酸缓冲盐水一 吐温(P B S-T)洗涤液 P B S 1 0 0 0 mL，吐温-2 0(T w e e n
8、-2 0)0.5 mL,混匀。A.4稀释 液(P B S-T-B S)P B S-T 1 0 0 mL，小牛血清 5 m L,混匀。A.5 邻苯二胺(O P D)底物液A.5.1 称取柠檬酸(CHa 0 7 H 2 0)2 1 g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至 1 0 0 0 mL,配成0.1 mo l/L柠檬酸液。A.5.2 称取磷酸氢二钠(Na i HP 0,1 2 H,0)7 1.6 g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1 0 0 0 m L;配成 0.2 m o l/L磷酸氢二钠(N a z HP O,1 2 H 2 0)液。A.5.3 取 A.5.1 溶液2 4.3 mL,A.5.2溶液 2 5.7 mL,混匀。A.5.4 取邻苯二胺2 0 m g溶于2 0 mL A.5.3 液中，临用前加3 0%双蒸水(H 0,)0.0 7 5 mL，即成底物液A.6 终止液(2 m o l/L硫酸)于 5 0 0 m L双蒸水中缓慢加人7 6 m L浓硫酸(9 8%),混匀。
