1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 3 7 6.2-2 0 0 4牛传染性胸膜肺炎补体结合试验方法Me t h o d o f c o mp l e me n t f i x a t i o n t e s t f o r c o n t a g i o u s b o v i n e p l e u r o p n e u m o n i a2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1实施中华人民共和匡国家 质 量 监 督 检 验检 疫 总 肩S N/T 1 3 7 6.2-2 0 0 4月q胃本标准的附录A、附录 B是规范性附录。本标准由国家认证认
2、可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国四川出人境检验检疫局。本标准主要起草人:李玉冰、严玉宝、曹宗君、胡娟、马勇。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 3 7 6.2-2 0 0 4牛传 染 性胸膜 肺 炎补体 结 合试 验 方 法范围本标准 规定了 牛传染性胸膜肺炎补体结合试 验方法。本标准适用于牛传染性胸膜肺炎的血清学诊断。2 试剂和材料2.1 材料2.1.1 玻璃试管。2.1.2 9 6孔血凝板。2.1.3 可调式加样器。2.1.4 试管架;2,1.5 普通离心机、9 6 孔板离心机。2.1.6 水浴锅。2.1.7 普通冰箱、普通冰柜。2.18 微
3、量振荡仪。2.2 试剂2.2.1 稀释液:灭菌巴比妥缓冲液(简称 V B液)见附录A,2.2.2 牛传染性胸膜肺炎补体结合试验抗原:由世界动物卫生组织(简称 O I E)牛传染性胸膜肺炎参考实验室提供，使用时按说明书使用。2.2.3 牛传染性胸膜肺炎补体结合试验标准阴性血清、标准阳性血清:由O I E牛传染性胸膜肺炎参考实验室 提供。使用前做1，1 0 倍稀释，5 6 水浴灭活3 0 m i n,2.2.4 溶血素。2.2.5 补体。2.2.6 6 0 a 绵羊红细胞悬浮液:见附录B,2.2.7 被检血清:按常规方法采集、分离、运输和保存。使用前做 1，功 倍稀释,S 6 水浴灭活3 0 mi
4、 na预备试验3，1 溶血素效价的测定3.1.1 1，2 0补体 的配制 0.5 M L 补体加人9.5 m L V B 液稀释成 1:2 0 补体置冰浴中，待用。3.1.2 1，1 0 0的溶血素的配制 取溶血素原液。.1 mL，加人V B液9.9 m L混匀制成 1 1 0 0 倍稀释的溶血素。3.1.3 不同稀释度的溶血素溶液的配制 用1，1 0 0 的 溶血素，按表1 用V B 液稀释溶血素并混匀。S N/T 1 3 7 6.2-2 0 0 4表 1 溶血紊稀释表单 位 为 毫 升试管号1 2345 一 7 8 一稀 释度1:1 0 0 01:2 0 0 01:3 0 0 01:4 0
5、 0 01 s5 0 0 01:6 0 0 01 7 0 0 01:8 0 0 01 9 0 0 01 100JV A A0.10.10.10.10.10.10.10.10.1v a液0 _ 91.92.93.94.95.96.97.99.93.1.4 溶血素效价测定试验 将试管架及各试管置于冰浴中，按表 2中各成分的量依次加人试管中浴作用3 0 m i n;将上述各试管 2 0 0 0 r/mi n 离心 5 min，观察结果。表 2溶血素效价测定表，振荡混匀，然后置于 3 7 水单 位 为 毫 升试管号123456789溶血素 对 照补体对 照红 细 胞 对 照溶 血 索稀 释 度1:1
6、0 0 0 1:2 0 0 0 13 0 0 0 1:4 0 0 01:5 0 0 0 1:6 0 0 0 1-7 0 0 0 1.8 0 0 01 e 9 0 0 0 1 1 0 0溶 血 素0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.201:20#M#0.10.1O l0.10.10.10.10.10.10.10.105%绵羊红 细 胞0.20 20.20.20.20.20 2o.20.z0,20 2O zV B液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.70.8结 果十+十+，宁丫下res r，r “一”表示 1 0 0 拓溶血，“+”表示 7 5 溶
7、血，“+”表示 5 0%溶血，“+十”表示2 5 肠溶血，“十+”表示。%溶血。3.1.5 溶血素效价的确定_3.1.5.1 溶血素对照组全部溶血，补体对照组、红细胞对照组不溶血，否则试验不成立，需重做。3.1.5.2 以5 0 溶血的溶血素的 最高稀释倍数为一个单位的溶血素，使用时用1 2 个单 位溶血素。如表 2 溶血素效价为 1:8 0 0 0，使用时应将溶血素稀释成效价为 1，6 6 6.6.3.2 补体效价的测定3.2.1 致敏红细胞的配制 将等量 6%的绵羊红细胞与 1 2 个单位的溶血素混匀，3 7 水浴 3 0 m i n后，置于 4 冰箱，备用。32.2 抗原 见2.2.2.
8、3.2.3 标准阴、阳性血清 见 2.2.3.3.2.4 补体稀释 按表3在冰浴中用VB液稀释补体。表 3补体稀释表单位为微升试 管 号1234567891 01 1稀释度1:3 01;3 51:4 01:4 51:5 01:5 51 6 01，7 01:8 01:9 01:1 0 0补体2 02 02 02 02 02 01 01 01 01 01 0V B 液5 9 06 8 07 8 08 8 09 8 01 0 8 05 9 06 9 07 9 08 9 09 9 0S N/T 1 3 7 6.2-2 0 0 43.2.5补体效价 的正式测定 按表 4、表 5、表 6、表 7 的要求，
9、将表中各成分的量依次加人试管中，振荡棍匀作用后，观察结果。表 4 补体效价测定阳性血清加抗原表单位为毫升试 管 号1234567891 01 1补体稀释度1:3 01:3 51:4 01:4 51:5 01:5 51:6 01:7 01，8 01:9 01:1 0 0补 体0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2阳性血清0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2抗原0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2振荡混匀后置 3 7 水浴作用3 0 min致 敏 红 细 胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.2
10、0.20.2振荡混匀后置 3 7 水浴作用3 0 min,离心2 0 0 0 r/mi n,1 0 mi n结 果一.，一，一 二，一，二 ，.，.，I:.一.二，一，气州卜-r-r州尸，叮了，r，.甲rTT，厂，rr 1T1TT气resr州 卜一 r se r 气 广 T一 r se r es r宁宁宁州-rwer气r-r气r-r州r州r表 5 补体效价测定阳性血清未加抗原表单 位 为 毫 升试管号1234567891 0补体对 照致 敏 红 细 胞 对 照补 体 稀释 度1:3 01:3 51:4 01:4 51:5 01:5 51:6 01:7 01:8 01:9 01:2 0补体0.2
11、0.20.20.20.20.20.20.20.20 20.2阳 性血 倩0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2va液0.20.20.20.20.20.20.20.20 20.20.40.6振荡馄匀后置3 7 水浴作用3 0 mi n致 敏红 细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2振荡混匀后置3 7 水浴作用 3 0 m i n，离心2 0 0 0 r/min,1 0 min结 果+1 二，二.。二+一resr，一 r r r表 6 补体效价测定阴性血清加抗原表单 位 为 毫 升试管号1234567891 0补 体 稀 释 度I:3 0
12、1:3 51:4 01:4 51:5 01:5 51:6 01:7 01 18 0I:9 0补 体0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2阴 性 血 清0.“一。.2一。.2一。.2一。.20.2一0.“一。.20.20.2抗 原一0.2一0.2一。.2一。.“一0.20.2一。.“一。.20.20.2振荡混匀后置 3 7 水浴作用3 0 min致敏红细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2振荡混匀后置 3 7 水浴作用3 0 min，离心2 0 0 0 r/mi n,1 0 mi n结果+十 十十+S N/T1 3 7 6.2 一2 D 0 4表
13、7 补体效价测定阴性血清未加抗原表单 位 为 毫 升试 管 号l234567891 0补体稀释度1 出3 01 13 51:4 01 公4 51:5 01:5 51:6 01，7 01 8 01:9 0补体0.20.20 20.20.20.20.20 20.20.2阴性 血 清0.20.20 20 20.20.20.20.20.20.2VB液0。20.20.20.20.20.20.20.20.20.2振荡均匀后置 37水浴 30 min致敏红细胞O 20.20.20.20.20 20 20 20.20.2振荡均匀后置 3 7 水浴3 omin，离心 Z0 0 0r/rnin，l omin结 果
14、-一+十+十3.2.6 补体效价的确定 在阳性血清加抗原管中完全不溶血，而阳性血清未加抗原管、阴性血清未加抗原管及阴性血清加抗原管中发生完全溶血的所需最小补体即为一个单位补体。如表7中一个单位补体为 1:55稀释度的补体。327 正式实验所需工作补体 在正式实验时使用25 个单位的补体。4 正式试验:4.1 抗原:见 2.2.2。42 标准阴性血清、阳性血清:见 2.2.3.4.3 补体:见 3.2.7。4.4 被检血清:见 2.2.7。4.5 致敏红细胞:见 3.2，1。4.6 对照设定:每个 96孔板均需设标准阴性血清、标准阳性血清、。.5单位补体、1 单位补体、25单位补体、致敏红细胞、
15、抗原对照。47 按表 8 将各成分依次加人96 孔板的孔中作用，然后置 96 孔板离心机上，2 0。:/min离心 sm in，观察结果。表 8 正式试验操作程序表单位为微升孔 号样 品对照123456789致 敏 红 细胞 对 照抗 原对 照血清被 检 血 清阳性血清阴 性 血 清补体对照试 验 孔对 照 孔试 验 孔对 照 孔试 验 孔对 照 孔0.5单位 1单位2.5单 位2 52 52 52 52 52 5抗 原一02 5 一2 50一2 5补体2 52 52 52 52 52 52 52 52 52 5V B 液 一。一2 5 一。一5 0 一5 07 52 5振 荡 混匀后置3 7
16、 水浴3 0rni n致 敏 红 细 胞 一2 5 一2 5 一2 5 一2 52 512 52 5振荡混匀后置 37二水浴3 Omin，20 0 Or/m i n，离心smn结果，;，一一+一!+一一 一!+一-，布 卞，一S N/T 1 3 7 6.2-2 0 0 44.8 结果判定4.8.1 观察对照组结果 阳性血清加抗原 对照 孔、致敏红细胞 对照 孔、0.5 单位补体对照 孔完 全不 溶血;I 个单位的补体孔出现部分溶血;阳 性血清未加抗原孔，阴性血清未加 抗原及阴性血清 加抗原孔，2.5 单位补体对照孔，抗原对照孔全部溶血;当 上述对照成立时，则继续观察被检血清。当对照孔与上述结果不一致时，试验应重做。4.8.2 观察被检血清结果4.8.2.1 在被检血清的试验孔及对照孔均全部溶血，被检血清为阴性。4.8.2.2 被检血清未加抗原孔全部溶血，被检血清加抗原孔出现完全不溶血，则被检血清为阳性.4.8.2.3 被检血清未加抗原孔全部溶血，而加抗原孔出现部分溶血即+”，“+”，“+十+”判为可疑，应重新检验一次。重做时，只有完全不溶血才能判为阳性。S N/T 1 3 7 6.2-
