1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 杀鲑气单胞菌的检验操作规程犘 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 狅 犳犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犳 狅 狉犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准参照了美国渔业协会的 鱼类某些病原的检测和鉴定程序（）版中“疖疮病”（犉 狌 狉 狌 狀 犮 狌 犾 狅 狊 犻 狊）一节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标
2、准主要起草人：张立怀、岳志芹、陈本龙、霍蕾、王建华、侯艳梅。犛 犖犜 杀鲑气单胞菌的检验操作规程范围本标准规定了杀鲑气单胞菌的检验程序。本标准适用于进出口鱼苗、幼鱼和成鱼的检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法设备材料 材料 胰蛋白胨大豆蛋白胨琼脂（）：见附录 实验用水应符合 规定。胰蛋白胨大豆蛋白胨血琼脂（）：见附录 。脑心浸液琼脂（）：见附录 。脑心浸液血琼脂平板（）见附录 。胰蛋白胨大豆蛋白胨肉汤（）：见附录 。考马斯亮蓝（
3、）：分析纯。微量生化反应管。特异性抗血清。设备 仪。电泳仪。凝胶成像系统。生化培养箱：。生物安全柜。解剖器械。样品的采集 无临床症状鱼，无菌采集其肾、肝、脾等。对于体表有临床症状的鱼，可以采集其病灶深处的组织。犛 犖犜 细菌分离鉴定 样品的接种用拭子或接种环将无菌操作采集的组织在 或 上划线。推荐接种在相应血琼脂平板 或 上，于 培养。从金鱼、鲤鱼等病鱼的病灶部位分离时，用拭子或接种环取样接种到 或 上，于 培养。为便于区分有毒力杀鲑气单胞菌的特异性菌落，可在培养基中加入 的考马斯亮蓝（）。杀鲑气单胞细菌在含 的 或 培养基上为深蓝、深紫色易碎的菌落，无毒力的菌株在该平板上为无色的菌落。杀鲑气
4、单胞菌的初步判定杀鲑气单胞菌菌体为革兰氏阴性短的（）（）杆菌或球杆菌，两极浓染。无运动性，色素氧化酶绝大多数阳性。大多数产生弥散性棕色色素，发酵葡萄糖。在 或 上，菌落大多数溶血。符合上述特征的细菌可初步判定为杀鲑气单胞菌。玻片凝集试验初步判定为杀鲑气单胞菌的菌株，可以用杀鲑气单胞菌的抗血清进行玻片凝集试验。在干净的载玻片上，加一滴生理盐水和一滴抗血清，取一环细菌分别在生理盐水和抗血清中混匀，内观察是否出现凝集。如果细菌在生理盐水中不凝集，在抗血清中凝集判定为杀鲑气单胞菌血清凝集阳性。如果细菌在生理盐水中凝集，则该菌为自凝菌株，不适用本试验鉴定。细菌的犘 犆 犚鉴定 引物杀鲑气单胞菌 基因扩增
5、的参考序列参见附录。按照表设计引物。表犘 犆 犚引物序列靶基因引物序列号引 物 序 列 产物大小表面阵列蛋白基因（）（）（）模板的制备对于分离的菌株，采用粗提的 进行鉴定。将平板上的菌落取接种环，加到 的无菌去离子水中，摇匀后，在 热处理 ，置冰上冷却。犵离心 ，取上清液用于检测。用已知杀鲑气单胞菌菌株作阳性对照，用无菌去离子水作阴性对照。细菌 的提取也可以采用等效试剂盒按说明书进行。犇 犖 犃扩增采用 反应体系：犛 犖犜 缓冲液 （）混合物（）引物 （）（）模板 犜 犪 狇 聚合酶（）灭菌去离子水 循环参数为：；变性 ，退火 ，延伸 ，个循环。延伸 。电泳用 电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶，加入
6、最终浓度为 的溴化乙锭。用 作为对照，对 产物进行电泳。在凝胶成像系统上观察有无 大小的特异性条带。必要时可以对扩增的条带进行测序分析。结果判定阴、阳性对照成立，检测检出特异条带的样品，判为条鲑气单胞菌 检测阳性。亚种确定初步判定为杀鲑气单胞菌后，可以进一步按表进行生化试验，确定其亚种。表杀鲑气单胞菌不同亚种的生化特性犪生 化 特 性犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪犪 犮 犺 狉 狅 犿 狅 犵 犲 狀 犲 狊犿 犪 狊 狅 狌 犮 犻 犱 犪狊 犿 犻 狋 犺 犻 犪吲哚甲基红 硫化氢产生赖氨酸脱羧酶精
7、氨酸双水解酶 葡萄糖产酸 葡萄糖产气 阿拉伯糖产酸 乳糖产酸甘油产酸麦芽糖产酸 甘露醇产酸蔗糖产酸海藻糖产酸七叶苷水解犛 犖犜 表（续）生 化 特 性犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪犪 犮 犺 狉 狅 犿 狅 犵 犲 狀 犲 狊犿 犪 狊 狅 狌 犮 犻 犱 犪狊 犿 犻 狋 犺 犻 犪脂肪酶（玉米油）棕色色素注：以上菌株呈阳性反应。：菌株呈阳性反应。：以上菌株呈阴性反应。：菌株呈阳性反应。：菌株呈阳性反应。：反应不稳定。生化试验的进行，可以参照购买的生化试剂使用说明书。应培养 判定结果。结果判定 分离菌
8、初步判定为杀鲑气单胞菌，与特异性抗血清凝集，符合杀鲑气单胞菌特性的，报告杀鲑气单胞菌检测阳性。分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，检测为阳性的，报告杀鲑气单胞菌检测阳性。分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，经进一步生化试验，符合杀鲑气单胞菌发生特性的，判定杀鲑气单胞菌检测阳性。未分离出细菌、所分离菌不符合杀鲑气单胞菌特性的，判定杀鲑气单胞菌检测阴性。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃 胰蛋白胨大豆琼脂平板（犜 犛 犃）的配制胰蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 先将以上成分溶解，调好 到 ，高压灭菌 ，倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。犃 胰蛋白胨大豆血琼脂平板（犜 犛 犃 犅）的配制
9、胰蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 先将以上成分溶解，调好 到 ，高压灭菌 ，将灭菌后的 冷却至 左右时，加入终浓度为的马血，混匀后倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。犃 脑心浸液琼脂平板（犅 犎 犐 犃）的配制牛心粉 胰蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 高铁血红素 维生素 盐酸半胱氨酸 氯化钠 磷酸氢二钾 刃天青 琼脂 蒸馏水 将上述成分溶解后，高压灭菌 ，冷却至 左右时，倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。犛 犖犜 犃 脑心浸液血琼脂平板（犅 犎 犐 犃 犅）的配制牛心粉 胰蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 高铁血红素 维生素 盐酸半胱氨酸 氯化钠 磷酸氢二钾 刃天青 琼脂 蒸馏水 将上述成分溶解后，高压灭菌 ，将灭菌后的 冷却至 左右时，加入终浓度为的马血，混匀后倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。犃 胰蛋白胨大豆肉汤（犜 犛 犅）的配制胰蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 先将以上成分溶解，调好 为 ，分装到试管中，管。高压灭菌 ，冷却后备用。如需加马血，待高压灭菌的 冷却至 左右时，加入终浓度为的马血。也可使用合格的等效成品培养基。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）杀鲑气单胞菌犞 犪 狆犃基因扩增的参考序列 犛 犖犜
