1、r -中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 4 4 5-2 0 0 4动物流行性乙型脑炎微量 血凝抑制试验Mi c r o-h e m a g g l u t i n a t io n i n h i b i t io n f o r J a p a n e s e e n c e p h a l i t i s v i r u s o f a n i ma l s2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1实施中华人民共和匡国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 婿S N/T 1 4 4 5-2 0 0 4前言本标准的附录A是规范性附录。本标准由国家认证
2、认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:李树清、胡永强、李健、徐红。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N I T 1 4 4 5-2 0 0 4动物流行性乙型脑炎微t血凝抑制试验范围本标准规定了微量血凝抑制试验检测动物流行性乙型脑炎抗体的方法。本标准适用于动物流行性乙型脑炎的检疫、流行病学调查和免疫监测。2材料2.1 试剂2.1.1 磷酸氢二钠(N a t HP O,1 2 H2 0),2.1.2 磷酸二氢钠(N a H,P O,2 H 2 0),2.1.3 氯化钠(N a C D,2.1.4 拘椽酸钠(N a,C s H
3、 s O 2 H,O。2.1.5 构摊酸(H,C,H,O,H,O),2.1.6 葡萄糖(C s H z O,H 2 0),2.1.7硼酸(H,B O,),2.1-.8 氢氧化钠(N a O H),2.1.9 牛血清白蛋白(B S A),2.1.1 0白陶土。2.、1 1 红细胞保存液、生理盐水、p H 9.0 硼酸盐溶液(B S),0.4%p H 9.0牛血清白蛋白硼酸盐溶液(B A S S)、红细胞稀释液、白陶土溶液的配制见附录 Ae 注:所有化学试剂均为分析纯。2.2 仪器设备2.2.1 9 6孔U型微量反应板。2.2.2 多通道、单通道可调移液器及加样头.2.2.3 1 0 mL无菌注射
4、器。2.2.4 离心管。2.2.5 1 0 mL和 1 mL吸管。2.2.6 天平(0.0 0 0 1 g).22.7 水浴锅。2.2.8 普通冰箱。2.2.9 恒温箱。2.2.1 0 微型振荡器。2.2.1 1 酸度计。2.2.1 2 普通低速离心机.2.3 标准试剂2.3.1 流行性乙型脑炎血凝素。2.3.2 流行性乙型脑炎阳性血清。2.3.3 流行性乙型脑炎阴性血清。IS N/T 1 4 4 5-2 0 0 42.4 试验动物 健康青年(4-1 6月龄)雄性鹅。3采样 被检动物无菌采血5 m L，待血液凝固后，以2 0 0 0 r/m i n 离心 1 0 m i n，分离血清，血清一2
5、 0 保存备用。4 操作方法4.1 制备鹅红细胞悬液 取 1 0 m L无菌注射器，先吸人红细胞保存液 0.5 mL，从鹅的翅静脉无菌采血5 mL，立即注人盛有1 5 m工左右红细胞保存液的容器中，不时摇动，3 m i n后置 4 冰箱过夜。次日将红细胞倒人离心管平衡后2 0 0 0 r/mi n 离心5 mi n，弃去上清液，离心管中加人 1 0 倍量生理盐水轻轻混匀，2 0 0 0 r/min离心5 m i n，如此反复三次，第三次用同样的速度离心1 0 m i n，尽量吸去上清液。用 1 m L吸管擂人离心管内红细胞泥的中心部，吸取所需的红细胞，用生理盐水配成 8%的红细胞悬液，余下的红
6、细胞泥 4 保存备用。再分别用 p H 6.0,p H 6.2,p H 6.4,p H 6.6,p H 6.8的红细胞稀释液将 8%的红细胞悬液作 2 4 倍稀释，制成0.3 3 写工作浓度不同p H值的红细胞悬液。4.2 处理被检血清 取 血清0.1 m 1，加2 5%的白陶土。.5 rn L,振荡 混匀，置3 7 C 1 h 或4 0 C 过夜。加入p H 9.0 的B S液0.4 ml-，摇匀后2 5 0 0 r/mi n 离心 3 0 min，取上清5 6 0C灭能3 0 mi n。加鹅红细胞泥0.0 5 mL,混匀，置3 7 0 C 恒温箱反应 2 0 mi n,1 5 0 0 r/
7、mi n 离心 1 0 m i n，保留上清液，弃沉淀。此上清液即为1:1 0 稀释度的被检血清。4.3 测定血凝素的最适p H值4.3.1 取9 6 孔 U型微量反应板，按表 1 标记。每孔均加人 2 5 p L B A B S，每排的第一孔加人2 5 fa L血凝素，混匀后吸2 5 p L至第二孔作等量倍比稀释至倒数第二孔，并从倒数第二孔中吸去 2 5 p L。最后一孔不加血凝素作为红细胞对照。4.3.2 每孔加B A B S 2 5 p L，充分摇匀，室温(2 0 0C 2 5 0 C)放置3 0 mi n-6 0 m i n,4.3.3 各排每孔分别加人不同 p H 0.3 3%工作浓
8、度的红细胞悬液 5 0 y L,摇匀后，3 7 放置 1h，判断结果，举例见表 1,表 1 血凝素最适p H测定结果1234567891 01 11 2不 同 p H的红 细胞 悬 液血凝素的稀释度1:21:41:81:1 61:3 21:6 41:1 2 81:2 5 61:5 1 21:1 0 2 41:2 0 4 8红 细 胞 对 照6.0井+6.2井井共#井井井+6.4井井牡拼仁护井一+6.6并#+十6.8井注 1;1:表示红细胞己 1 0 0 凝集，呈一层薄膜状，受集颗粒均匀分布于整个孔底.注 2;+表示红细胞约 7 5%凝集，但孔底仍有红细胞沉淀成滴状，周围已形成膜状。注3.+表示
9、红细胞约 5 0%凝集，血滴周围有凝集颗粒，但不呈膜状。注 4:+表示红细胞约 2 5 凝集.血滴周围仅有少量的凝集颗粒.注 5:一表示红细胞 0%凝集，呈圆滴状沉淀于孔底，周围无凝集颗粒S N/T 1 4 4 5-2 0 0 4 由表 1 可见该血凝素在p H 6.4 的条件下凝血效价最佳，所以p H 6.4 定为该血凝素的最适p H值.4.4 测定血凝素的工作浓度4.4.1 用最适p H的红细胞悬液重新滴定血凝素效价。取 9 6 孔 U型微量反应板，按表2标记，每孔均加人2 5 p L B A B S,第一孔加人2 5 p L血 凝素，混匀后吸2 5 p L 至第二孔作等量倍比稀释至倒数第
10、二孔，并从倒数第二孔中吸去2 5 p L。最后一孔不加血凝素作为红细胞对照。4.4.2 每孔加B A B S 2 5 p L，充分摇匀，室温(2 0 0C-2 5 0C)放置3 0 m i n-6 0 m i n.4.4.3 每孔均 加人p H 6.4 0.3 3%红细胞悬液(最适p H的 红细 胞悬液)5 0 川，充分摇匀后，3 7 放置1h，判断结果，举例见表 2.表 2 血凝素工作浓度的测定结果1234567891 01 11 2血凝素的稀释度1:21:41:81,1 61:3 21:6 41:1 28 1 2 561:51 21:1 0 2 41:2 0 4 8红 细 胞 对 照并仁仁
11、共仁井#1“十+能与红细胞凝集成“十+”的最高稀释度定为血凝素的一个单位(HA U)，表 2中的血凝素单位为1，1 0 2 4。在血凝抑制试验中，所用的“血凝素单位”要求在 2 5 ,L中含8个HA U，即1，1 2 8.4.5血凝抑制试验4.5.1 加样4.5.1.1 标记反应板 取 9 6 孔U型微量反应板，按表3 标记。表3 微f血凝抑制试验1234567891 01 11 2样 品稀释倍 数S1S 2S 3S 4S 5S 6S 7S 8S 9阴 性对 照翼 篮血 授 素对 照A1 1 0#井拼井井井井井8 单 位B1 12 0#护井七七仁4 单 位C1:4 0井拼护拼共井井书K2单 位
12、D1,8 0井仁牡仁+1 单 位E1:1 6 0+翁井G仁#仁仁+1/2 单 位F1.3 2 0井共并拼扛井共仁+一一1/4 单位一G1:6 4 0牡井#井拼共井仁仁 1/8 单 位H血 清 对 照 红 细胞 对照注 1,S为样品的英文简写注 2:凝集结果判定参见表 1注4.5.1.2 倍 比稀释血清 每次试验均设阴性血清、阳性血清对照。阴性血清、阳性血清与样品同样稀释。样品及血清对照第2 -8 排每孔加人 2 5 1 L B AB S，第 1,2 和 8 排中 1-1 1 孔分别加人对应经处理的1:1 0 血清2 5 FL L，自 第2 排开始混匀后吸2 5 11 1 至第3 排，第3 排混
13、匀吸2 5 1,L 至第4 排，如此倍比稀释至第7 排，第7 排混匀后弃去2 5 V L。血清稀 释度 相应为1:1 0-1，6 4 0。第8 排1-1 1 孔作为相应的血清对照。S N/T 1 4 4 5-2 0 0 44.5.1.3 设立血凝紊及红细胞对照 第 1 2列为血凝素及红细胞对照，从上往下数第2-8孔每孔加人 2 5 K L B AB S，第 1,2孔每孔加人8 单位血凝素2 5 p L，自 第2 孔开始混匀后吸2 5 p L 至第3 孔，第3 孔混匀吸2 5 y L 至 第4 孔，如此倍比稀释至第 7 孔，第7 孔混匀后弃去2 5 p L。血凝素相应为8 HA U,4 H AU
14、,2 H AU,1 HA U,1/2 HA U,1/4 H A U,1/8 H A U。第8 孔加 人2 5 u L B A B S 作为 红细胞对照。4.5.2 加血凝紊 第 1 1 1 列除第 8排外，每孔加人 8 H AU工作浓度的血凝素 2 5 Ii L，第 1 2列每孔加人 2 5 ILB A B S,混匀后，室温(2 0 0C-2 5 0C)放置 3 0 min-6 0 mi n,4.5.3 加红细胞 每孔均加人p H 6.4 0.3 3%工作浓度的红 细胞悬液5 0 p L，轻轻摇匀后，3 7 放置1 h,5 结 果判定5.1 对照 红细胞对照和血清对照无凝集，阴性对照完全凝集。
15、阳性对照的血凝抑制滴度与已知滴度不得相差 1 个滴度以上。血凝素对照如表 3所示:8单位、4 单位和 2 单位血凝素完全凝集，1单位血凝素 5 0%左右凝集。1/2,1/4,1/8 单位血凝素2 5%以下凝集。5.2 检测样本判定5.2.1 判定方法 对照成立的情况下，以能完全抑制红细胞凝集的最高稀释倍数作为该血清的血凝抑制抗体效价。如表 3 所示，S 1 的血凝抑制抗体效价为 1，8 0，而 S 2 的血凝抑制抗体效价为 1，3 2 0,5.2.2 判定标准 猪血清的血凝抑制抗体效价大于或等于 1，2 0 判为流行性乙型脑炎抗体阳性。马、骡血清的血凝抑制抗体效价大于或等于 1，4 0判为流行
16、性乙型脑炎抗 体阳性。S N/T 1 4 4 5-2 0 0 4 附录A(规范性附录)试 剂配制A.1 红细胞保存液(Ac id-c i t r a t e-d e x t r o s e,A CD)的配制抓化钠(N a C D 4.2 g拘椽酸钠(N a,C,H;O,2 H,0)8.0 g拘椽酸(H,C,H,O,H,O)0.5 5 g葡萄糖(C,H 0 s H,0)2 0.5 g加蒸馏水分别溶解后，定容至 1 0 0 0 mL。分装，1 1 5 灭菌 1 0 m i n.置4 保存备用。A.2 生理盐水的配制称 8.5 g N a C I 加蒸溜水溶解后，定容至 1 0 0 0 m工，分装，1 1 5 灭菌 1 0 m i n,4 保存备用。A.3 p H 9.0 硼酸盐溶液(b o r a t e s a l i n e,B S)的配制 称 3 0.9 2 g H,B O。加 7 0 0 mL热蒸馏水溶解，冷却后定容至1 0 0 0 mL,配制成。.5 mo l/L的硼酸溶液，4 保存备用。称4 0.0 g N a O H，加蒸馏水溶解后，定容至 1 0 0 0 mL，配制成 1.
