1、SN/T1907-2007前言本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：巩红霞、廉慧锋、连庚寅、巩强、吴海军、雷雨平、李卫华、张祖维。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1907-2007液，管壁残留的奶样用灭菌的棉签擦掉，加入400LTE。4.2DNA模板的提取4.2.180水浴加热20min,冷至室温。4.2.2加50L溶菌酶（参见第A.2章），37气浴振荡培养1h。4.2.3加75LSDS/蛋白酶K(参见第A.3章)，混匀，65水浴加热10 min。4.2.4加 100
2、 L 5 mol/L NaCl和100L 65预热5 min的CTAB/NaCl(参见第A.4章)，上下混匀，直至液体变为白色（奶状），65水浴加热10min。4.2.5加750L三甲烷：异戊醇(24：1)，混匀，12000 r/min室温离心5 min。4.2.6取上层水相于新管，加等体积的三氯甲烷：异戊醇(24：1)，混匀，12000r/min室温离心5min。4.2.7取上层水相于新管，小心加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，小心手摇混匀，-20放置30min,12000r/min室温离心15min。4.2.8弃上清液，加入500L预冷的70%的乙醇，12.000r/min室温离中5 min
3、,弃上清液。4.2.9小心吸走液体，室温下干燥10min左右，用50LTE(参见第A.1章)溶解，4保存。4.3PCR法4.3.1引物：来源于美国农业部：正向引物：Primer90:5-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3反向引物：Primer91:5-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3扩增副结核分枝杆菌基因中的400bpDNA带，循环条件：93变性1min,58退火1min,72延伸3min,共33个循环。4.3.2PCR反应体系见表1，检测过程中要设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用副结核标准菌株的模板DNA作阳性对照，用其他非副结核菌的模板DNA做阴性对照，用水作空白对
4、照模板。表1PCR反应体系试剂名称贮备液浓度加入反应体系的体积/L500 mmol/L KCl.100 mmo/L Tris-Cl10PCR Buffer(不含Mg2+)2.5(pH8.3温下)氯化镁(MgCl2)25 mmel/L1.5dNTP MixturedATPdCTP,dGTP、dTTP(各 3.2 mol)2.0引物100 pol/uL各0.5Taq酶5U/0.25模板DNA2.0ddH2 O补足至反应总体积为25L注：反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。4.3.3PCR扩增产物电泳检测取1.5g琼脂糖，加入100mL电泳缓冲液（参见第A.6章）加热溶解，加入溴化乙锭至终浓度为1 g/mL,制胶，将 5 L8 L的 Marker和 PCR扩增产物分别与适量的加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压，电泳40min左右，凝胶成像分析系统检测并记录结果。5结果判定及表述PCR后，阳性对照会出现一条400bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该核酸带，待检样品中如出现400bp的DNA片段为检测结果阳性，即检出副结核分枝杆菌。如未出现400bp的DNA片段为检测结果阴性，即未检出副结核分枝杆菌。2
